rsem-calculate-expression

   1 #!/usr/bin/env perl
   2
   3 use Getopt::Long;
   4 use Pod::Usage;
   5
   6 use FindBin;
   7 use lib $FindBin::RealBin;
   8 use rsem_perl_utils qw(runCommand collectResults showVersionInfo);
   9
  10 use Env qw(@PATH);
  11 @PATH = ($FindBin::RealBin, "$FindBin::RealBin/sam", @PATH);
  12
  13 use strict;
  14
  15 #const
  16 my $BURNIN = 200;
  17 my $NCV = 1000;
  18 my $SAMPLEGAP = 1;
  19 my $CONFIDENCE = 0.95;
  20 my $NSPC = 50;
  21
  22 my $NMB = 1024; # default
  23 my $SortMem = "1G"; # default as 1G per thread
  24
  25 my $status = 0;
  26
  27 my $read_type = 1; # default, single end with qual
  28
  29 my $bowtie_path = "";
  30 my $C = 2;
  31 my $E = 99999999;
  32 my $L = 25;
  33 my $maxHits = 200;
  34 my $chunkMbs = 0;       # 0 = use bowtie default
  35 my $phred33 = 0;
  36 my $phred64 = 0;
  37 my $solexa = 0;
  38
  39 my $is_sam = 0;
  40 my $is_bam = 0;
  41 my $fn_list = "";
  42 my $tagName = "XM";
  43
  44 my $probF = 0.5;
  45
  46 my $minL = 1;
  47 my $maxL = 1000;
  48 my $mean = -1;
  49 my $sd = 0;
  50
  51 my $estRSPD = 0;
  52 my $B = 20;
  53
  54 my $nThreads = 1;
  55 my $genBamF = 1;  # default is generating transcript bam file
  56 my $genGenomeBamF = 0;
  57 my $sampling = 0;
  58 my $calcPME = 0;
  59 my $calcCI = 0;
  60 my $quiet = 0;
  61 my $help = 0;
  62
  63 my $paired_end = 0;
  64 my $no_qual = 0;
  65 my $keep_intermediate_files = 0;
  66
  67 my $strand_specific = 0;
  68
  69 my $bowtie2 = 0;
  70 my $bowtie2_path = "";
  71 my $bowtie2_mismatch_rate = 0.1;
  72 my $bowtie2_k = 200;
  73 my $bowtie2_sensitivity_level = "sensitive"; # must be one of "very_fast", "fast", "sensitive", "very_sensitive"
  74
  75 my $seed = "NULL";
  76
  77 my $version = 0;
  78
  79 my $mTime = 0;
  80 my ($time_start, $time_end, $time_alignment, $time_rsem, $time_ci) = (0, 0, 0, 0, 0);
  81
  82 my $mate1_list = "";
  83 my $mate2_list = "";
  84 my $inpF = "";
  85
  86 my ($refName, $sampleName, $sampleToken, $temp_dir, $stat_dir, $imdName, $statName) = ();
  87 my $gap = 32;
  88
  89 my $alleleS = 0;
  90
  91 GetOptions("keep-intermediate-files" => \$keep_intermediate_files,
  92            "temporary-folder=s" => \$temp_dir,
  93            "no-qualities" => \$no_qual,
  94            "paired-end" => \$paired_end,
  95            "strand-specific" => \$strand_specific,
  96            "sam" => \$is_sam,
  97            "bam" => \$is_bam,
  98            "sam-header-info=s" => \$fn_list,
  99            "tag=s" => \$tagName,
 100            "seed-length=i" => \$L,
 101            "bowtie-path=s" => \$bowtie_path,
 102            "bowtie-n=i" => \$C,
 103            "bowtie-e=i" => \$E,
 104            "bowtie-m=i" => \$maxHits,
 105            "bowtie-chunkmbs=i" => \$chunkMbs,
 106            "phred33-quals" => \$phred33,
 107            "phred64-quals" => \$phred64, #solexa1.3-quals" => \$phred64,
 108            "solexa-quals" => \$solexa,
 109            "bowtie2" => \$bowtie2,
 110            "bowtie2-path=s" => \$bowtie2_path,
 111            "bowtie2-mismatch-rate=f" => \$bowtie2_mismatch_rate,
 112            "bowtie2-k=i" => \$bowtie2_k,
 113            "bowtie2-sensitivity-level=s" => \$bowtie2_sensitivity_level,
 114            "forward-prob=f" => \$probF,
 115            "fragment-length-min=i" => \$minL,
 116            "fragment-length-max=i" => \$maxL,
 117            "fragment-length-mean=f" => \$mean,
 118            "fragment-length-sd=f" => \$sd,
 119            "estimate-rspd" => \$estRSPD,
 120            "num-rspd-bins=i" => \$B,
 121            "p|num-threads=i" => \$nThreads,
 122            "no-bam-output" => sub { $genBamF = 0; },
 123            "output-genome-bam" => \$genGenomeBamF,
 124            "sampling-for-bam" => \$sampling,
 125            "calc-pme" => \$calcPME,
 126            "gibbs-burnin=i" => \$BURNIN,
 127            "gibbs-number-of-samples=i" => \$NCV,
 128            "gibbs-sampling-gap=i", \$SAMPLEGAP,
 129            "calc-ci" => \$calcCI,
 130            "ci-credibility-level=f" => \$CONFIDENCE,
 131            "ci-memory=i" => \$NMB,
 132            "ci-number-of-samples-per-count-vector=i" => \$NSPC,
 133            "samtools-sort-mem=s" => \$SortMem,
 134            "seed=i" => \$seed,
 135            "time" => \$mTime,
 136            "version" => \$version,
 137            "q|quiet" => \$quiet,
 138            "h|help" => \$help) or pod2usage(-exitval => 2, -verbose => 2);
 139
 140 pod2usage(-verbose => 2) if ($help == 1);
 141 &showVersionInfo($FindBin::RealBin) if ($version == 1);
 142
 143 #check parameters and options
 144
 145 if ($is_sam || $is_bam) {
 146     pod2usage(-msg => "Invalid number of arguments!", -exitval => 2, -verbose => 2) if (scalar(@ARGV) != 3);
 147     pod2usage(-msg => "--sam and --bam cannot be active at the same time!", -exitval => 2, -verbose => 2) if ($is_sam == 1&& $is_bam == 1);
 148     pod2usage(-msg => "--bowtie-path, --bowtie-n, --bowtie-e, --bowtie-m, --phred33-quals, --phred64-quals, --solexa-quals, --bowtie2, --bowtie2-path, --bowtie2-mismatch-rate, --bowtie2-k and --bowtie2-sensitivity-level cannot be set if input is SAM/BAM format!", -exitval => 2, -verbose => 2) if ($bowtie_path ne "" || $C != 2 || $E != 99999999 || $maxHits != 200 || $phred33 || $phred64 || $solexa || $bowtie2 || $bowtie2_path ne "" || $bowtie2_mismatch_rate != 0.1 || $bowtie2_k != 200 || $bowtie2_sensitivity_level ne "sensitive");
 149 }
 150 else {
 151     pod2usage(-msg => "Invalid number of arguments!", -exitval => 2, -verbose => 2) if (!$paired_end && scalar(@ARGV) != 3 || $paired_end && scalar(@ARGV) != 4);
 152     pod2usage(-msg => "If --no-qualities is set, neither --phred33-quals, --phred64-quals or --solexa-quals can be active!", -exitval => 2, -verbose => 2) if ($no_qual && ($phred33 + $phred64 + $solexa > 0));
 153     pod2usage(-msg => "Only one of --phred33-quals, --phred64-quals, and --solexa-quals can be active!", -exitval => 2, -verbose => 2) if ($phred33 + $phred64 + $solexa > 1);
 154     pod2usage(-msg => "--sam , --bam or --sam-header-info cannot be set if use bowtie/bowtie2 aligner to produce alignments!", -exitval => 2, -verbose => 2) if ($is_sam || $is_bam || $fn_list ne "");
 155     pod2usage(-msg => "--bowtie2-path, --bowtie2-mismatch-rate, --bowtie2-k and --bowtie2-sensitivity-level cannot be set if bowtie aligner is used!", -exitval => 2, -verbose => 2) if (!$bowtie2 && ($bowtie2_path ne "" || $bowtie2_mismatch_rate != 0.1 || $bowtie2_k != 200 || $bowtie2_sensitivity_level ne "sensitive"));
 156     pod2usage(-msg => "--bowtie-path, --bowtie-n, --bowtie-e, --bowtie-m cannot be set if bowtie2 aligner is used!", -exitval => 2, -verbose => 2) if ($bowtie2 && ($bowtie_path ne "" || $C != 2 || $E != 99999999 || $maxHits != 200));
 157     pod2usage(-msg => "Mismatch rate must be within [0, 1]!", -exitval => 2, -verbose => 2) if ($bowtie2 && ($bowtie2_mismatch_rate < 0.0 || $bowtie2_mismatch_rate > 1.0));
 158     pod2usage(-msg => "Sensitivity level must be one of \"very_fast\", \"fast\", \"sensitive\", and \"very_sensitive\"!", -exitval => 2, -verbose => 2) if ($bowtie2 && (($bowtie2_sensitivity_level ne "very_fast") && ($bowtie2_sensitivity_level ne "fast") && ($bowtie2_sensitivity_level ne "sensitive") && ($bowtie2_sensitivity_level ne "very_sensitive")));
 159 }
 160
 161 pod2usage(-msg => "Forward probability should be in [0, 1]!", -exitval => 2, -verbose => 2) if ($probF < 0 || $probF > 1);
 162 pod2usage(-msg => "Min fragment length should be at least 1!", -exitval => 2, -verbose => 2) if ($minL < 1);
 163 pod2usage(-msg => "Min fragment length should be smaller or equal to max fragment length!", -exitval => 2, -verbose => 2) if ($minL > $maxL);
 164 pod2usage(-msg => "The memory allocated for calculating credibility intervals should be at least 1 MB!\n", -exitval => 2, -verbose => 2) if ($NMB < 1);
 165 pod2usage(-msg => "Number of threads should be at least 1!\n", -exitval => 2, -verbose => 2) if ($nThreads < 1);
 166 pod2usage(-msg => "Seed length should be at least 5!\n", -exitval => 2, -verbose => 2) if ($L < 5);
 167 pod2usage(-msg => "--sampling-for-bam cannot be specified if --no-bam-output is specified!\n", -exitval => 2, -verbose => 2) if ($sampling && !$genBamF);
 168 pod2usage(-msg => "--output-genome-bam cannot be specified if --no-bam-output is specified!\n", -exitval => 2, -verbose => 2) if ($genGenomeBamF && !$genBamF);
 169 pod2usage(-msg => "The seed for random number generator must be a non-negative 32bit integer!\n", -exitval => 2, -verbose => 2) if (($seed ne "NULL") && ($seed < 0 || $seed > 0xffffffff));
 170 pod2usage(-msg => "The credibility level should be within (0, 1)!\n", -exitval => 2, -verbose => 2) if ($CONFIDENCE <= 0.0 || $CONFIDENCE >= 1.0);
 171
 172 if ($L < 25) { print "Warning: the seed length set is less than 25! This is only allowed if the references are not added poly(A) tails.\n"; }
 173
 174 if ($strand_specific) { $probF = 1.0; }
 175
 176 if ($paired_end) {
 177     if ($no_qual) { $read_type = 2; }
 178     else { $read_type = 3; }
 179 }
 180 else {
 181     if ($no_qual) { $read_type = 0; }
 182     else { $read_type = 1; }
 183 }
 184
 185 if (scalar(@ARGV) == 3) {
 186     if ($is_sam || $is_bam) { $inpF = $ARGV[0]; }
 187     else {$mate1_list = $ARGV[0]; }
 188     $refName = $ARGV[1];
 189     $sampleName = $ARGV[2];
 190 }
 191 else {
 192     $mate1_list = $ARGV[0];
 193     $mate2_list = $ARGV[1];
 194     $refName = $ARGV[2];
 195     $sampleName = $ARGV[3];
 196 }
 197
 198 if (((-e "$refName.ta") && !(-e "$refName.gt")) || (!(-e "$refName.ta") && (-e "$refName.gt"))) {
 199     print "Allele-specific expression related reference files are corrupted!\n";
 200     exit(-1);
 201 }
 202
 203 $alleleS = (-e "$refName.ta") && (-e "$refName.gt");
 204
 205 if ($genGenomeBamF) {
 206     open(INPUT, "$refName.ti");
 207     my $line = <INPUT>; chomp($line);
 208     close(INPUT);
 209     my ($M, $type) = split(/ /, $line);
 210     pod2usage(-msg => "No genome information provided, so genome bam file cannot be generated!\n", -exitval => 2, -verbose => 2) if ($type != 0);
 211 }
 212
 213 my $pos = rindex($sampleName, '/');
 214 if ($pos < 0) { $sampleToken = $sampleName; }
 215 else { $sampleToken = substr($sampleName, $pos + 1); }
 216
 217 if ($temp_dir eq "") { $temp_dir = "$sampleName.temp"; }
 218 $stat_dir = "$sampleName.stat";
 219
 220 if (!(-d $temp_dir) && !mkdir($temp_dir)) { print "Fail to create folder $temp_dir.\n"; exit(-1); }
 221 if (!(-d $stat_dir) && !mkdir($stat_dir)) { print "Fail to create folder $stat_dir.\n"; exit(-1); }
 222
 223 $imdName = "$temp_dir/$sampleToken";
 224 $statName = "$stat_dir/$sampleToken";
 225
 226 if (!$is_sam && !$is_bam && !$no_qual && ($phred33 + $phred64 + $solexa == 0)) { $phred33 = 1; }
 227
 228 my ($mate_minL, $mate_maxL) = (1, $maxL);
 229
 230 if ($bowtie_path ne "") { $bowtie_path .= "/"; }
 231 if ($bowtie2_path ne "") { $bowtie2_path .= "/"; }
 232
 233 my $command = "";
 234
 235 if (!$is_sam && !$is_bam) {
 236     if (!$bowtie2) {
 237         $command = $bowtie_path."bowtie";
 238         if ($no_qual) { $command .= " -f"; }
 239         else { $command .= " -q"; }
 240
 241         if ($phred33) { $command .= " --phred33-quals"; }
 242         elsif ($phred64) { $command .= " --phred64-quals"; }
 243         elsif ($solexa) { $command .= " --solexa-quals"; }
 244
 245         $command .= " -n $C -e $E -l $L";
 246         if ($read_type == 2 || $read_type == 3) { $command .= " -I $minL -X $maxL"; }
 247         if ($chunkMbs > 0) { $command .= " --chunkmbs $chunkMbs"; }
 248
 249         if ($strand_specific || $probF == 1.0) { $command .= " --norc"; }
 250         elsif ($probF == 0.0) { $command .= " --nofw"; }
 251
 252         $command .= " -p $nThreads -a -m $maxHits -S";
 253         if ($quiet) { $command .= " --quiet"; }
 254
 255         $command .= " $refName";
 256         if ($read_type == 0 || $read_type == 1) {
 257             $command .= " $mate1_list";
 258         }
 259         else {
 260             $command .= " -1 $mate1_list -2 $mate2_list";
 261         }
 262
 263         # pipe to samtools to generate a BAM file
 264         $command .= " | samtools view -S -b -o $imdName.bam -";
 265     }
 266     else {
 267         $command = $bowtie2_path."bowtie2";
 268         if ($no_qual) { $command .= " -f"; }
 269         else { $command .= " -q"; }
 270
 271         if ($phred33) { $command .= " --phred33"; }
 272         elsif ($phred64) { $command .= " --phred64"; }
 273         elsif ($solexa) { $command .= " --solexa-quals"; }
 274
 275         if ($bowtie2_sensitivity_level eq "very_fast") { $command .= " --very-fast"; }
 276         elsif ($bowtie2_sensitivity_level eq "fast") { $command .= " --fast"; }
 277         elsif ($bowtie2_sensitivity_level eq "sensitive") { $command .= " --sensitive"; }
 278         else { $command .= " --very-sensitive"; }
 279
 280         $command .= " --dpad 0 --gbar 99999999 --mp 1,1 --np 1 --score-min L,0,-$bowtie2_mismatch_rate";
 281
 282         if ($read_type == 2 || $read_type == 3) { $command .= " -I $minL -X $maxL --no-mixed --no-discordant"; }
 283
 284         if ($strand_specific || $probF == 1.0) { $command .= " --norc"; }
 285         elsif ($probF == 0.0) { $command .= " --nofw"; }
 286
 287         $command .= " -p $nThreads -k $bowtie2_k";
 288         if ($quiet) { $command .= " --quiet"; }
 289
 290         $command .= " -x $refName";
 291         if ($read_type == 0 || $read_type == 1) {
 292             $command .= " -U $mate1_list";
 293         }
 294         else {
 295             $command .= " -1 $mate1_list -2 $mate2_list";
 296         }
 297
 298         # pipe to samtools to generate a BAM file
 299         $command .= " | samtools view -S -b -o $imdName.bam -";
 300     }
 301
 302     if ($mTime) { $time_start = time(); }
 303
 304     &runCommand($command);
 305
 306     if ($mTime) { $time_end = time(); $time_alignment = $time_end - $time_start; }
 307
 308     $inpF = "$imdName.bam";
 309     $is_bam = 1; # alignments are outputed as a BAM file
 310 }
 311
 312 if ($mTime) { $time_start = time(); }
 313
 314 $command = "rsem-parse-alignments $refName $imdName $statName";
 315
 316 my $samInpType;
 317 if ($is_sam) { $samInpType = "s"; }
 318 elsif ($is_bam) { $samInpType = "b"; }
 319
 320 $command .= " $samInpType $inpF -t $read_type";
 321 if ($fn_list ne "") { $command .= " -l $fn_list"; }
 322 if ($tagName ne "") { $command .= " -tag $tagName"; }
 323 if ($quiet) { $command .= " -q"; }
 324
 325 &runCommand($command);
 326
 327 $command = "rsem-build-read-index $gap";
 328 if ($read_type == 0) { $command .= " 0 $quiet $imdName\_alignable.fa"; }
 329 elsif ($read_type == 1) { $command .= " 1 $quiet $imdName\_alignable.fq"; }
 330 elsif ($read_type == 2) { $command .= " 0 $quiet $imdName\_alignable_1.fa $imdName\_alignable_2.fa"; }
 331 elsif ($read_type == 3) { $command .= " 1 $quiet $imdName\_alignable_1.fq $imdName\_alignable_2.fq"; }
 332 else { print "Impossible! read_type is not in [1,2,3,4]!\n"; exit(-1); }
 333 &runCommand($command);
 334
 335 my $doesOpen = open(OUTPUT, ">$imdName.mparams");
 336 if ($doesOpen == 0) { print "Cannot generate $imdName.mparams!\n"; exit(-1); }
 337 print OUTPUT "$minL $maxL\n";
 338 print OUTPUT "$probF\n";
 339 print OUTPUT "$estRSPD\n";
 340 print OUTPUT "$B\n";
 341 print OUTPUT "$mate_minL $mate_maxL\n";
 342 print OUTPUT "$mean $sd\n";
 343 print OUTPUT "$L\n";
 344 close(OUTPUT);
 345
 346 my @seeds = ();
 347 if ($seed ne "NULL") {
 348     srand($seed);
 349     for (my $i = 0; $i < 3; $i++) {
 350         push(@seeds, int(rand(1 << 32)));
 351     }
 352 }
 353
 354 $command = "rsem-run-em $refName $read_type $sampleName $imdName $statName -p $nThreads";
 355 if ($genBamF) {
 356     $command .= " -b $samInpType $inpF";
 357     if ($fn_list ne "") { $command .= " 1 $fn_list"; }
 358     else { $command .= " 0"; }
 359     if ($sampling) { $command .= " --sampling"; }
 360     if ($seed ne "NULL") { $command .= " --seed $seeds[0]"; }
 361 }
 362 if ($calcPME || $calcCI) { $command .= " --gibbs-out"; }
 363 if ($quiet) { $command .= " -q"; }
 364
 365 &runCommand($command);
 366
 367 if ($alleleS) {
 368     &collectResults("allele", "$imdName.allele_res", "$sampleName.alleles.results"); # allele level
 369     &collectResults("isoform", "$imdName.iso_res", "$sampleName.isoforms.results"); # isoform level
 370     &collectResults("gene", "$imdName.gene_res", "$sampleName.genes.results"); # gene level
 371 }
 372 else {
 373     &collectResults("isoform", "$imdName.iso_res", "$sampleName.isoforms.results"); # isoform level
 374     &collectResults("gene", "$imdName.gene_res", "$sampleName.genes.results"); # gene level
 375 }
 376
 377 if ($genBamF) {
 378     $command = "samtools sort -@ $nThreads -m $SortMem $sampleName.transcript.bam $sampleName.transcript.sorted";
 379     &runCommand($command);
 380     $command = "samtools index $sampleName.transcript.sorted.bam";
 381     &runCommand($command);
 382
 383     if ($genGenomeBamF) {
 384         $command = "rsem-tbam2gbam $refName $sampleName.transcript.bam $sampleName.genome.bam";
 385         &runCommand($command);
 386         $command = "samtools sort -@ $nThreads -m $SortMem $sampleName.genome.bam $sampleName.genome.sorted";
 387         &runCommand($command);
 388         $command = "samtools index $sampleName.genome.sorted.bam";
 389         &runCommand($command);
 390     }
 391 }
 392
 393 if ($mTime) { $time_end = time(); $time_rsem = $time_end - $time_start; }
 394
 395 if ($mTime) { $time_start = time(); }
 396
 397 if ($calcPME || $calcCI ) {
 398     $command = "rsem-run-gibbs $refName $imdName $statName $BURNIN $NCV $SAMPLEGAP";
 399     $command .= " -p $nThreads";
 400     if ($seed ne "NULL") { $command .= " --seed $seeds[1]"; }
 401     if ($quiet) { $command .= " -q"; }
 402     &runCommand($command);
 403 }
 404
 405 if ($calcPME || $calcCI) {
 406     if ($alleleS) {
 407         system("mv $sampleName.alleles.results $imdName.alleles.results.bak1");
 408         system("mv $sampleName.isoforms.results $imdName.isoforms.results.bak1");
 409         system("mv $sampleName.genes.results $imdName.genes.results.bak1");
 410         &collectResults("allele", "$imdName.allele_res", "$sampleName.alleles.results"); # allele level
 411         &collectResults("isoform", "$imdName.iso_res", "$sampleName.isoforms.results"); # isoform level
 412         &collectResults("gene", "$imdName.gene_res", "$sampleName.genes.results"); # gene level
 413     }
 414     else {
 415         system("mv $sampleName.isoforms.results $imdName.isoforms.results.bak1");
 416         system("mv $sampleName.genes.results $imdName.genes.results.bak1");
 417         &collectResults("isoform", "$imdName.iso_res", "$sampleName.isoforms.results"); # isoform level
 418         &collectResults("gene", "$imdName.gene_res", "$sampleName.genes.results"); # gene level
 419     }
 420 }
 421
 422 if ($calcCI) {
 423     $command = "rsem-calculate-credibility-intervals $refName $imdName $statName $CONFIDENCE $NCV $NSPC $NMB";
 424     $command .= " -p $nThreads";
 425     if ($seed ne "NULL") { $command .= " --seed $seeds[2]"; }
 426     if ($quiet) { $command .= " -q"; }
 427     &runCommand($command);
 428
 429     if ($alleleS) {
 430         system("mv $sampleName.alleles.results $imdName.alleles.results.bak2");
 431         system("mv $sampleName.isoforms.results $imdName.isoforms.results.bak2");
 432         system("mv $sampleName.genes.results $imdName.genes.results.bak2");
 433         &collectResults("allele", "$imdName.allele_res", "$sampleName.alleles.results"); # allele level
 434         &collectResults("isoform", "$imdName.iso_res", "$sampleName.isoforms.results"); # isoform level
 435         &collectResults("gene", "$imdName.gene_res", "$sampleName.genes.results"); # gene level
 436     }
 437     else {
 438         system("mv $sampleName.isoforms.results $imdName.isoforms.results.bak2");
 439         system("mv $sampleName.genes.results $imdName.genes.results.bak2");
 440         &collectResults("isoform", "$imdName.iso_res", "$sampleName.isoforms.results"); # isoform level
 441         &collectResults("gene", "$imdName.gene_res", "$sampleName.genes.results"); # gene level
 442     }
 443 }
 444
 445 if ($mTime) { $time_end = time(); $time_ci = $time_end - $time_start; }
 446
 447 if ($mTime) { $time_start = time(); }
 448
 449 if (!$keep_intermediate_files) {
 450     &runCommand("rm -rf $temp_dir", "Fail to delete the temporary folder!");
 451 }
 452
 453 if ($mTime) { $time_end = time(); }
 454
 455 if ($mTime) {
 456     open(OUTPUT, ">$sampleName.time");
 457     print OUTPUT "Aligning reads: $time_alignment s.\n";
 458     print OUTPUT "Estimating expression levels: $time_rsem s.\n";
 459     print OUTPUT "Calculating credibility intervals: $time_ci s.\n";
 460 #    my $time_del = $time_end - $time_start;
 461 #    print OUTPUT "Delete: $time_del s.\n";
 462     close(OUTPUT);
 463 }
 464
 465 __END__
 466
 467 =head1 NAME
 468
 469 rsem-calculate-expression
 470
 471 =head1 SYNOPSIS
 472
 473  rsem-calculate-expression [options] upstream_read_file(s) reference_name sample_name
 474  rsem-calculate-expression [options] --paired-end upstream_read_file(s) downstream_read_file(s) reference_name sample_name
 475  rsem-calculate-expression [options] --sam/--bam [--paired-end] input reference_name sample_name
 476
 477 =head1 ARGUMENTS
 478
 479 =over
 480
 481 =item B<upstream_read_files(s)>
 482
 483 Comma-separated list of files containing single-end reads or upstream reads for paired-end data.  By default, these files are assumed to be in FASTQ format.  If the --no-qualities option is specified, then FASTA format is expected.
 484
 485 =item B<downstream_read_file(s)>
 486
 487 Comma-separated list of files containing downstream reads which are paired with the upstream reads.  By default, these files are assumed to be in FASTQ format.  If the --no-qualities option is specified, then FASTA format is expected.
 488
 489 =item B<input>
 490
 491 SAM/BAM formatted input file.  If "-" is specified for the filename, SAM/BAM input is instead assumed to come from standard input. RSEM requires all alignments of the same read group together. For paired-end reads, RSEM also requires the two mates of any alignment be adjacent. See Description section for how to make input file obey RSEM's requirements.
 492
 493 =item B<reference_name>
 494
 495 The name of the reference used.  The user must have run 'rsem-prepare-reference' with this reference_name before running this program.
 496
 497 =item B<sample_name>
 498
 499 The name of the sample analyzed. All output files are prefixed by this name (e.g., sample_name.genes.results)
 500
 501 =back
 502
 503 =head1 BASIC OPTIONS
 504
 505 =over
 506
 507 =item B<--paired-end>
 508
 509 Input reads are paired-end reads. (Default: off)
 510
 511 =item B<--no-qualities>
 512
 513 Input reads do not contain quality scores. (Default: off)
 514
 515 =item B<--strand-specific>
 516
 517 The RNA-Seq protocol used to generate the reads is strand specific, i.e., all (upstream) reads are derived from the forward strand.  This option is equivalent to --forward-prob=1.0.  With this option set, if RSEM runs the Bowtie/Bowtie 2 aligner, the '--norc' Bowtie/Bowtie 2 option will be used, which disables alignment to the reverse strand of transcripts.  (Default: off)
 518
 519 =item B<--bowtie2>
 520
 521 Use Bowtie 2 instead of Bowtie to align reads. Since currently RSEM does not handle indel, local and discordant alignments, the Bowtie2 parameters are set in a way to avoid those alignments. In particular, we use options '--sensitive --dpad 0 --gbar 99999999 --mp 1,1 --np 1 --score-min L,0,-0.1' by default. "-0.1", the last parameter of '--score-min' is the negative value of the maximum mismatch rate allowed. This rate can be set by option '--bowtie2-mismatch-rate'. If reads are paired-end, we additionally use options '--no-mixed' and '--no-discordant'. (Default: off)
 522
 523 =item B<--sam>
 524
 525 Input file is in SAM format. (Default: off)
 526
 527 =item B<--bam>
 528
 529 Input file is in BAM format. (Default: off)
 530
 531 =item B<-p/--num-threads> <int>
 532
 533 Number of threads to use. Both Bowtie/Bowtie2, expression estimation and 'samtools sort' will use this many threads. (Default: 1)
 534
 535 =item B<--no-bam-output>
 536
 537 Do not output any BAM file. (Default: off)
 538
 539 =item B<--output-genome-bam>
 540
 541 Generate a BAM file, 'sample_name.genome.bam', with alignments mapped to genomic coordinates and annotated with their posterior probabilities. In addition, RSEM will call samtools (included in RSEM package) to sort and index the bam file. 'sample_name.genome.sorted.bam' and 'sample_name.genome.sorted.bam.bai' will be generated. (Default: off)
 542
 543 =item B<--sampling-for-bam>
 544
 545 When RSEM generates a BAM file, instead of outputing all alignments a read has with their posterior probabilities, one alignment is sampled according to the posterior probabilities. The sampling procedure includes the alignment to the "noise" transcript, which does not appear in the BAM file. Only the sampled alignment has a weight of 1. All other alignments have weight 0. If the "noise" transcript is sampled, all alignments appeared in the BAM file should have weight 0. (Default: off)
 546
 547 =item B<--seed> <uint32>
 548
 549 Set the seed for the random number generators used in calculating posterior mean estimates and credibility intervals. The seed must be a non-negative 32 bit interger. (Default: off)
 550
 551 =item B<--calc-pme>
 552
 553 Run RSEM's collapsed Gibbs sampler to calculate posterior mean estimates. (Default: off)
 554
 555 =item B<--calc-ci>
 556
 557 Calculate 95% credibility intervals and posterior mean estimates. The credibility level can be changed by setting '--ci-credibility-level'. (Default: off)
 558
 559 =item B<-q/--quiet>
 560
 561 Suppress the output of logging information. (Default: off)
 562
 563 =item B<-h/--help>
 564
 565 Show help information.
 566
 567 =item B<--version>
 568
 569 Show version information.
 570
 571 =back
 572
 573 =head1 ADVANCED OPTIONS
 574
 575 =over
 576
 577 =item B<--sam-header-info> <file>
 578
 579 RSEM reads header information from input by default. If this option is on, header information is read from the specified file. For the format of the file, please see SAM official website. (Default: "")
 580
 581 =item B<--seed-length> <int>
 582
 583 Seed length used by the read aligner.  Providing the correct value is important for RSEM. If RSEM runs Bowtie, it uses this value for Bowtie's seed length parameter. Any read with its or at least one of its mates' (for paired-end reads) length less than this value will be ignored. If the references are not added poly(A) tails, the minimum allowed value is 5, otherwise, the minimum allowed value is 25. Note that this script will only check if the value >= 5 and give a warning message if the value < 25 but >= 5. (Default: 25)
 584
 585 =item B<--tag> <string>
 586
 587 The name of the optional field used in the SAM input for identifying a read with too many valid alignments. The field should have the format <tagName>:i:<value>, where a <value> bigger than 0 indicates a read with too many alignments. (Default: "")
 588
 589 =item B<--bowtie-path> <path>
 590
 591 The path to the Bowtie executables. (Default: the path to the Bowtie executables is assumed to be in the user's PATH environment variable)
 592
 593 =item B<--bowtie-n> <int>
 594
 595 (Bowtie parameter) max # of mismatches in the seed. (Range: 0-3, Default: 2)
 596
 597 =item B<--bowtie-e> <int>
 598
 599 (Bowtie parameter) max sum of mismatch quality scores across the alignment. (Default: 99999999)
 600
 601 =item B<--bowtie-m> <int>
 602
 603 (Bowtie parameter) suppress all alignments for a read if > <int> valid alignments exist. (Default: 200)
 604
 605 =item B<--bowtie-chunkmbs> <int>
 606
 607 (Bowtie parameter) memory allocated for best first alignment calculation (Default: 0 - use Bowtie's default)
 608
 609 =item B<--phred33-quals>
 610
 611 Input quality scores are encoded as Phred+33. (Default: on)
 612
 613 =item B<--phred64-quals>
 614
 615 Input quality scores are encoded as Phred+64 (default for GA Pipeline ver. >= 1.3). (Default: off)
 616
 617 =item B<--solexa-quals>
 618
 619 Input quality scores are solexa encoded (from GA Pipeline ver. < 1.3). (Default: off)
 620
 621 =item B<--bowtie2-path> <path>
 622
 623 (Bowtie 2 parameter) The path to the Bowtie 2 executables. (Default: the path to the Bowtie 2 executables is assumed to be in the user's PATH environment variable)
 624
 625 =item B<--bowtie2-mismatch-rate> <double>
 626
 627 (Bowtie 2 parameter) The maximum mismatch rate allowed. (Default: 0.1)
 628
 629 =item B<--bowtie2-k> <int>
 630
 631 (Bowtie 2 parameter) Find up to <int> alignments per read. (Default: 200)
 632
 633 =item B<--bowtie2-sensitivity-level> <string>
 634
 635 (Bowtie 2 parameter) Set Bowtie 2's preset options in --end-to-end mode. This option controls how hard Bowtie 2 tries to find alignments. <string> must be one of "very_fast", "fast", "sensitive" and "very_sensitive". The four candidates correspond to Bowtie 2's "--very-fast", "--fast", "--sensitive" and "--very-sensitive" options. (Default: "sensitive" - use Bowtie 2's default)
 636
 637 =item B<--forward-prob> <double>
 638
 639 Probability of generating a read from the forward strand of a transcript. Set to 1 for a strand-specific protocol where all (upstream) reads are derived from the forward strand, 0 for a strand-specific protocol where all (upstream) read are derived from the reverse strand, or 0.5 for a non-strand-specific protocol. (Default: 0.5)
 640
 641 =item B<--fragment-length-min> <int>
 642
 643 Minimum read/insert length allowed. This is also the value for the Bowtie/Bowtie2 -I option. (Default: 1)
 644
 645 =item B<--fragment-length-max> <int>
 646
 647 Maximum read/insert length allowed. This is also the value for the Bowtie/Bowtie 2 -X option. (Default: 1000)
 648
 649 =item B<--fragment-length-mean> <double>
 650
 651 (single-end data only) The mean of the fragment length distribution, which is assumed to be a Gaussian. (Default: -1, which disables use of the fragment length distribution)
 652
 653 =item B<--fragment-length-sd> <double>
 654
 655 (single-end data only) The standard deviation of the fragment length distribution, which is assumed to be a Gaussian.  (Default: 0, which assumes that all fragments are of the same length, given by the rounded value of B<--fragment-length-mean>)
 656
 657 =item B<--estimate-rspd>
 658
 659 Set this option if you want to estimate the read start position distribution (RSPD) from data. Otherwise, RSEM will use a uniform RSPD. (Default: off)
 660
 661 =item B<--num-rspd-bins> <int>
 662
 663 Number of bins in the RSPD. Only relevant when '--estimate-rspd' is specified.  Use of the default setting is recommended. (Default: 20)
 664
 665 =item B<--gibbs-burnin> <int>
 666
 667 The number of burn-in rounds for RSEM's Gibbs sampler. Each round passes over the entire data set once. If RSEM can use multiple threads, multiple Gibbs samplers will start at the same time and all samplers share the same burn-in number. (Default: 200)
 668
 669 =item B<--gibbs-number-of-samples> <int>
 670
 671 The total number of count vectors RSEM will collect from its Gibbs samplers. (Default: 1000)
 672
 673 =item B<--gibbs-sampling-gap> <int>
 674
 675 The number of rounds between two succinct count vectors RSEM collects. If the count vector after round N is collected, the count vector after round N + <int> will also be collected. (Default: 1)
 676
 677 =item B<--ci-credibility-level> <double>
 678
 679 The credibility level for credibility intervals. (Default: 0.95)
 680
 681 =item B<--ci-memory> <int>
 682
 683 Maximum size (in memory, MB) of the auxiliary buffer used for computing credibility intervals (CI). Set it larger for a faster CI calculation. However, leaving 2 GB memory free for other usage is recommended. (Default: 1024)
 684
 685 =item B<--ci-number-of-samples-per-count-vector> <int>
 686
 687 The number of read generating probability vectors sampled per sampled count vector. The crebility intervals are calculated by first sampling P(C | D) and then sampling P(Theta | C) for each sampled count vector. This option controls how many Theta vectors are sampled per sampled count vector. (Default: 50)
 688
 689 =item B<--samtools-sort-mem> <string>
 690
 691 Set the maximum memory per thread that can be used by 'samtools sort'. <string> represents the memory and accepts suffices 'K/M/G'. RSEM will pass <string> to the '-m' option of 'samtools sort'.  Please note that the default used here is different from the default used by samtools. (Default: 1G)
 692
 693 =item B<--keep-intermediate-files>
 694
 695 Keep temporary files generated by RSEM.  RSEM creates a temporary directory, 'sample_name.temp', into which it puts all intermediate output files. If this directory already exists, RSEM overwrites all files generated by previous RSEM runs inside of it. By default, after RSEM finishes, the temporary directory is deleted.  Set this option to prevent the deletion of this directory and the intermediate files inside of it. (Default: off)
 696
 697 =item B<--temporary-folder> <string>
 698
 699 Set where to put the temporary files generated by RSEM. If the folder specified does not exist, RSEM will try to create it. (Default: sample_name.temp)
 700
 701 =item B<--time>
 702
 703 Output time consumed by each step of RSEM to 'sample_name.time'. (Default: off)
 704
 705 =back
 706
 707 =head1 DESCRIPTION
 708
 709 In its default mode, this program aligns input reads against a reference transcriptome with Bowtie and calculates expression values using the alignments.  RSEM assumes the data are single-end reads with quality scores, unless the '--paired-end' or '--no-qualities' options are specified.  Users may use an alternative aligner by specifying one of the --sam and --bam options, and providing an alignment file in the specified format. However, users should make sure that they align against the indices generated by 'rsem-prepare-reference' and the alignment file satisfies the requirements mentioned in ARGUMENTS section.
 710
 711 One simple way to make the alignment file satisfying RSEM's requirements (assuming the aligner used put mates in a paired-end read adjacent) is to use 'convert-sam-for-rsem' script. This script only accept SAM format files as input. If a BAM format file is obtained, please use samtools to convert it to a SAM file first. For example, if '/ref/mouse_125' is the 'reference_name' and the SAM file is named 'input.sam', you can run the following command:
 712
 713   convert-sam-for-rsem /ref/mouse_125 input.sam -o input_for_rsem.sam
 714
 715 For details, please refer to 'convert-sam-for-rsem's documentation page.
 716
 717 The SAM/BAM format RSEM uses is v1.4. However, it is compatible with old SAM/BAM format. However, RSEM cannot recognize 0x100 in the FLAG field. In addition, RSEM requires SEQ and QUAL are not '*'.
 718
 719 The user must run 'rsem-prepare-reference' with the appropriate reference before using this program.
 720
 721 For single-end data, it is strongly recommended that the user provide the fragment length distribution parameters (--fragment-length-mean and --fragment-length-sd).  For paired-end data, RSEM will automatically learn a fragment length distribution from the data.
 722
 723 Please note that some of the default values for the Bowtie parameters are not the same as those defined for Bowtie itself.
 724
 725 The temporary directory and all intermediate files will be removed when RSEM finishes unless '--keep-intermediate-files' is specified.
 726
 727 With the '--calc-ci' option, 95% credibility intervals and posterior mean estimates will be calculated in addition to maximum likelihood estimates.
 728
 729 =head1 OUTPUT
 730
 731 =over
 732
 733 =item B<sample_name.isoforms.results>
 734
 735 File containing isoform level expression estimates. The first line
 736 contains column names separated by the tab character. The format of
 737 each line in the rest of this file is:
 738
 739 transcript_id gene_id length effective_length expected_count TPM FPKM IsoPct [posterior_mean_count posterior_standard_deviation_of_count pme_TPM pme_FPKM IsoPct_from_pme_TPM TPM_ci_lower_bound TPM_ci_upper_bound FPKM_ci_lower_bound FPKM_ci_upper_bound]
 740
 741 Fields are separated by the tab character. Fields within "[]" are
 742 optional. They will not be presented if neither '--calc-pme' nor
 743 '--calc-ci' is set.
 744
 745 'transcript_id' is the transcript name of this transcript. 'gene_id'
 746 is the gene name of the gene which this transcript belongs to (denote
 747 this gene as its parent gene). If no gene information is provided,
 748 'gene_id' and 'transcript_id' are the same.
 749
 750 'length' is this transcript's sequence length (poly(A) tail is not
 751 counted). 'effective_length' counts only the positions that can
 752 generate a valid fragment. If no poly(A) tail is added,
 753 'effective_length' is equal to transcript length - mean fragment
 754 length + 1. If one transcript's effective length is less than 1, this
 755 transcript's both effective length and abundance estimates are set to
 756 0.
 757
 758 'expected_count' is the sum of the posterior probability of each read
 759 comes from this transcript over all reads. Because 1) each read
 760 aligning to this transcript has a probability of being generated from
 761 background noise; 2) RSEM may filter some alignable low quality reads,
 762 the sum of expected counts for all transcript are generally less than
 763 the total number of reads aligned.
 764
 765 'TPM' stands for Transcripts Per Million. It is a relative measure of
 766 transcript abundance. The sum of all transcripts' TPM is 1
 767 million. 'FPKM' stands for Fragments Per Kilobase of transcript per
 768 Million mapped reads. It is another relative measure of transcript
 769 abundance. If we define l_bar be the mean transcript length in a
 770 sample, which can be calculated as
 771
 772 l_bar = \sum_i TPM_i / 10^6 * effective_length_i (i goes through every transcript),
 773
 774 the following equation is hold:
 775
 776 FPKM_i = 10^3 / l_bar * TPM_i.
 777
 778 We can see that the sum of FPKM is not a constant across samples.
 779
 780 'IsoPct' stands for isoform percentage. It is the percentage of this
 781 transcript's abandunce over its parent gene's abandunce. If its parent
 782 gene has only one isoform or the gene information is not provided,
 783 this field will be set to 100.
 784
 785 'posterior_mean_count', 'pme_TPM', 'pme_FPKM' are posterior mean
 786 estimates calculated by RSEM's Gibbs
 787 sampler. 'posterior_standard_deviation_of_count' is the posterior
 788 standard deviation of counts. 'IsoPct_from_pme_TPM' is the isoform
 789 percentage calculated from 'pme_TPM' values.
 790
 791 'TPM_ci_lower_bound', 'TPM_ci_upper_bound', 'FPKM_ci_lower_bound' and
 792 'FPKM_ci_upper_bound' are lower(l) and upper(u) bounds of 95%
 793 credibility intervals for TPM and FPKM values. The bounds are
 794 inclusive (i.e. [l, u]).
 795
 796 =item B<sample_name.genes.results>
 797
 798 File containing gene level expression estimates. The first line
 799 contains column names separated by the tab character. The format of
 800 each line in the rest of this file is:
 801
 802 gene_id transcript_id(s) length effective_length expected_count TPM FPKM [posterior_mean_count posterior_standard_deviation_of_count pme_TPM pme_FPKM TPM_ci_lower_bound TPM_ci_upper_bound FPKM_ci_lower_bound FPKM_ci_upper_bound]
 803
 804 Fields are separated by the tab character. Fields within "[]" are
 805 optional. They will not be presented if neither '--calc-pme' nor
 806 '--calc-ci' is set.
 807
 808 'transcript_id(s)' is a comma-separated list of transcript_ids
 809 belonging to this gene. If no gene information is provided, 'gene_id'
 810 and 'transcript_id(s)' are identical (the 'transcript_id').
 811
 812 A gene's 'length' and 'effective_length' are
 813 defined as the weighted average of its transcripts' lengths and
 814 effective lengths (weighted by 'IsoPct'). A gene's abundance estimates
 815 are just the sum of its transcripts' abundance estimates.
 816
 817 =item B<sample_name.alleles.results>
 818
 819 Only generated when the RSEM references are built with allele-specific
 820 transcripts.
 821
 822 This file contains allele level expression estimates for
 823 allele-specific expression calculation. The first line
 824 contains column names separated by the tab character. The format of
 825 each line in the rest of this file is:
 826
 827 allele_id transcript_id gene_id length effective_length expected_count TPM FPKM AlleleIsoPct AlleleGenePct [posterior_mean_count posterior_standard_deviation_of_count pme_TPM pme_FPKM AlleleIsoPct_from_pme_TPM AlleleGenePct_from_pme_TPM TPM_ci_lower_bound TPM_ci_upper_bound FPKM_ci_lower_bound FPKM_ci_upper_bound]
 828
 829 Fields are separated by the tab character. Fields within "[]" are
 830 optional. They will not be presented if neither '--calc-pme' nor
 831 '--calc-ci' is set.
 832
 833 'allele_id' is the allele-specific name of this allele-specific transcript.
 834
 835 'AlleleIsoPct' stands for allele-specific percentage on isoform
 836 level. It is the percentage of this allele-specific transcript's
 837 abundance over its parent transcript's abundance. If its parent
 838 transcript has only one allele variant form, this field will be set to
 839 100.
 840
 841 'AlleleGenePct' stands for allele-specific percentage on gene
 842 level. It is the percentage of this allele-specific transcript's
 843 abundance over its parent gene's abundance.
 844
 845 'AlleleIsoPct_from_pme_TPM' and 'AlleleGenePct_from_pme_TPM' have
 846 similar meanings. They are calculated based on posterior mean
 847 estimates.
 848
 849 Please note that if this file is present, the fields 'length' and
 850 'effective_length' in 'sample_name.isoforms.results' should be
 851 interpreted similarly as the corresponding definitions in
 852 'sample_name.genes.results'.
 853
 854 =item B<sample_name.transcript.bam, sample_name.transcript.sorted.bam and sample_name.transcript.sorted.bam.bai>
 855
 856 Only generated when --no-bam-output is not specified.
 857
 858 'sample_name.transcript.bam' is a BAM-formatted file of read
 859 alignments in transcript coordinates. The MAPQ field of each alignment
 860 is set to min(100, floor(-10 * log10(1.0 - w) + 0.5)), where w is the
 861 posterior probability of that alignment being the true mapping of a
 862 read.  In addition, RSEM pads a new tag ZW:f:value, where value is a
 863 single precision floating number representing the posterior
 864 probability. Because this file contains all alignment lines produced
 865 by bowtie or user-specified aligners, it can also be used as a
 866 replacement of the aligner generated BAM/SAM file. For paired-end
 867 reads, if one mate has alignments but the other does not, this file
 868 marks the alignable mate as "unmappable" (flag bit 0x4) and appends an
 869 optional field "Z0:A:!".
 870
 871 'sample_name.transcript.sorted.bam' and
 872 'sample_name.transcript.sorted.bam.bai' are the sorted BAM file and
 873 indices generated by samtools (included in RSEM package).
 874
 875 =item B<sample_name.genome.bam, sample_name.genome.sorted.bam and sample_name.genome.sorted.bam.bai>
 876
 877 Only generated when --no-bam-output is not specified and --output-genome-bam is specified.
 878
 879 'sample_name.genome.bam' is a BAM-formatted file of read alignments in
 880 genomic coordinates. Alignments of reads that have identical genomic
 881 coordinates (i.e., alignments to different isoforms that share the
 882 same genomic region) are collapsed into one alignment.  The MAPQ field
 883 of each alignment is set to min(100, floor(-10 * log10(1.0 - w) +
 884 0.5)), where w is the posterior probability of that alignment being
 885 the true mapping of a read.  In addition, RSEM pads a new tag
 886 ZW:f:value, where value is a single precision floating number
 887 representing the posterior probability. If an alignment is spliced, a
 888 XS:A:value tag is also added, where value is either '+' or '-'
 889 indicating the strand of the transcript it aligns to.
 890
 891 'sample_name.genome.sorted.bam' and 'sample_name.genome.sorted.bam.bai' are the
 892 sorted BAM file and indices generated by samtools (included in RSEM package).
 893
 894 =item B<sample_name.time>
 895
 896 Only generated when --time is specified.
 897
 898 It contains time (in seconds) consumed by aligning reads, estimating expression levels and calculating credibility intervals.
 899
 900 =item B<sample_name.stat>
 901
 902 This is a folder instead of a file. All model related statistics are stored in this folder. Use 'rsem-plot-model' can generate plots using this folder.
 903
 904 =back
 905
 906 =head1 EXAMPLES
 907
 908 Assume the path to the bowtie executables is in the user's PATH environment variable. Reference files are under '/ref' with name 'mouse_125'.
 909
 910 1) '/data/mmliver.fq', single-end reads with quality scores. Quality scores are encoded as for 'GA pipeline version >= 1.3'. We want to use 8 threads and generate a genome BAM file:
 911
 912  rsem-calculate-expression --phred64-quals \
 913                            -p 8 \
 914                            --output-genome-bam \
 915                            /data/mmliver.fq \
 916                            /ref/mouse_125 \
 917                            mmliver_single_quals
 918
 919 2) '/data/mmliver_1.fq' and '/data/mmliver_2.fq', paired-end reads with quality scores. Quality scores are in SANGER format. We want to use 8 threads and do not generate a genome BAM file:
 920
 921  rsem-calculate-expression -p 8 \
 922                            --paired-end \
 923                            /data/mmliver_1.fq \
 924                            /data/mmliver_2.fq \
 925                            /ref/mouse_125 \
 926                            mmliver_paired_end_quals
 927
 928 3) '/data/mmliver.fa', single-end reads without quality scores. We want to use 8 threads:
 929
 930  rsem-calculate-expression -p 8 \
 931                            --no-qualities \
 932                            /data/mmliver.fa \
 933                            /ref/mouse_125 \
 934                            mmliver_single_without_quals
 935
 936 4) Data are the same as 1). This time we assume the bowtie executables are under '/sw/bowtie'. We want to take a fragment length distribution into consideration. We set the fragment length mean to 150 and the standard deviation to 35. In addition to a BAM file, we also want to generate credibility intervals. We allow RSEM to use 1GB of memory for CI calculation:
 937
 938  rsem-calculate-expression --bowtie-path /sw/bowtie \
 939                            --phred64-quals \
 940                            --fragment-length-mean 150.0 \
 941                            --fragment-length-sd 35.0 \
 942                            -p 8 \
 943                            --output-genome-bam \
 944                            --calc-ci \
 945                            --ci-memory 1024 \
 946                            /data/mmliver.fq \
 947                            /ref/mouse_125 \
 948                            mmliver_single_quals
 949
 950 5) '/data/mmliver_paired_end_quals.bam', paired-end reads with quality scores. We want to use 8 threads:
 951
 952  rsem-calculate-expression --paired-end \
 953                            --bam \
 954                            -p 8 \
 955                            /data/mmliver_paired_end_quals.bam \
 956                            /ref/mouse_125 \
 957                            mmliver_paired_end_quals
 958
 959 =cut