bcftools/call1.c

   1 #include <unistd.h>
   2 #include <stdlib.h>
   3 #include <math.h>
   4 #include <zlib.h>
   5 #include <errno.h>
   6 #include "bcf.h"
   7 #include "prob1.h"
   8 #include "kstring.h"
   9 #include "time.h"
  10
  11 #ifdef _WIN32
  12 #define srand48(x) srand(x)
  13 #define lrand48() rand()
  14 #endif
  15
  16 #include "kseq.h"
  17 KSTREAM_INIT(gzFile, gzread, 16384)
  18
  19 #define VC_NO_GENO 2
  20 #define VC_BCFOUT  4
  21 #define VC_CALL    8
  22 #define VC_VARONLY 16
  23 #define VC_VCFIN   32
  24 #define VC_UNCOMP  64
  25 #define VC_KEEPALT 256
  26 #define VC_ACGT_ONLY 512
  27 #define VC_QCALL   1024
  28 #define VC_CALL_GT 2048
  29 #define VC_ADJLD   4096
  30 #define VC_NO_INDEL 8192
  31 #define VC_ANNO_MAX 16384
  32 #define VC_FIX_PL   32768
  33 #define VC_EM       0x10000
  34 #define VC_PAIRCALL 0x20000
  35 #define VC_QCNT     0x40000
  36 #define VC_INDEL_ONLY 0x80000
  37
  38 typedef struct {
  39         int flag, prior_type, n1, n_sub, *sublist, n_perm;
  40         uint32_t *trio_aux;
  41         char *prior_file, **subsam, *fn_dict;
  42         uint8_t *ploidy;
  43         double theta, pref, indel_frac, min_perm_p, min_smpl_frac, min_lrt, min_ma_lrt;
  44         void *bed;
  45 } viewconf_t;
  46
  47 void *bed_read(const char *fn);
  48 void bed_destroy(void *_h);
  49 int bed_overlap(const void *_h, const char *chr, int beg, int end);
  50
  51 static double ttest(int n1, int n2, int a[4])
  52 {
  53         extern double kf_betai(double a, double b, double x);
  54         double t, v, u1, u2;
  55         if (n1 == 0 || n2 == 0 || n1 + n2 < 3) return 1.0;
  56         u1 = (double)a[0] / n1; u2 = (double)a[2] / n2;
  57         if (u1 <= u2) return 1.;
  58         t = (u1 - u2) / sqrt(((a[1] - n1 * u1 * u1) + (a[3] - n2 * u2 * u2)) / (n1 + n2 - 2) * (1./n1 + 1./n2));
  59         v = n1 + n2 - 2;
  60 //      printf("%d,%d,%d,%d,%lf,%lf,%lf\n", a[0], a[1], a[2], a[3], t, u1, u2);
  61         return t < 0.? 1. : .5 * kf_betai(.5*v, .5, v/(v+t*t));
  62 }
  63
  64 static int test16_core(int anno[16], anno16_t *a)
  65 {
  66         extern double kt_fisher_exact(int n11, int n12, int n21, int n22, double *_left, double *_right, double *two);
  67         double left, right;
  68         int i;
  69         a->p[0] = a->p[1] = a->p[2] = a->p[3] = 1.;
  70         memcpy(a->d, anno, 4 * sizeof(int));
  71         a->depth = anno[0] + anno[1] + anno[2] + anno[3];
  72         a->is_tested = (anno[0] + anno[1] > 0 && anno[2] + anno[3] > 0);
  73         if (a->depth == 0) return -1;
  74         a->mq = (int)(sqrt((anno[9] + anno[11]) / a->depth) + .499);
  75         kt_fisher_exact(anno[0], anno[1], anno[2], anno[3], &left, &right, &a->p[0]);
  76         for (i = 1; i < 4; ++i)
  77                 a->p[i] = ttest(anno[0] + anno[1], anno[2] + anno[3], anno+4*i);
  78         return 0;
  79 }
  80
  81 int test16(bcf1_t *b, anno16_t *a)
  82 {
  83         char *p;
  84         int i, anno[16];
  85         a->p[0] = a->p[1] = a->p[2] = a->p[3] = 1.;
  86         a->d[0] = a->d[1] = a->d[2] = a->d[3] = 0.;
  87         a->mq = a->depth = a->is_tested = 0;
  88         if ((p = strstr(b->info, "I16=")) == 0) return -1;
  89         p += 4;
  90         for (i = 0; i < 16; ++i) {
  91                 errno = 0; anno[i] = strtol(p, &p, 10);
  92                 if (anno[i] == 0 && (errno == EINVAL || errno == ERANGE)) return -2;
  93                 ++p;
  94         }
  95         return test16_core(anno, a);
  96 }
  97
  98 static int update_bcf1(bcf1_t *b, const bcf_p1aux_t *pa, const bcf_p1rst_t *pr, double pref, int flag, double em[10], int cons_llr, int64_t cons_gt)
  99 {
 100         kstring_t s;
 101         int has_I16, is_var;
 102         double fq, r;
 103         anno16_t a;
 104
 105         has_I16 = test16(b, &a) >= 0? 1 : 0;
 106         //rm_info(b, "I16="); // FIXME: probably this function has a bug. If I move it below, I16 will not be removed!
 107
 108         memset(&s, 0, sizeof(kstring_t));
 109         kputc('\0', &s); kputs(b->ref, &s); kputc('\0', &s);
 110         kputs(b->alt, &s); kputc('\0', &s); kputc('\0', &s);
 111         kputs(b->info, &s);
 112         if (b->info[0]) kputc(';', &s);
 113         { // print EM
 114                 if (em[0] >= 0) ksprintf(&s, "AF1=%.4g", 1 - em[0]);
 115                 if (em[4] >= 0 && em[4] <= 0.05) ksprintf(&s, ";G3=%.4g,%.4g,%.4g;HWE=%.3g", em[3], em[2], em[1], em[4]);
 116                 if (em[5] >= 0 && em[6] >= 0) ksprintf(&s, ";AF2=%.4g,%.4g", 1 - em[5], 1 - em[6]);
 117                 if (em[7] >= 0) ksprintf(&s, ";LRT=%.3g", em[7]);
 118                 if (em[8] >= 0) ksprintf(&s, ";LRT2=%.3g", em[8]);
 119         }
 120         if (cons_llr > 0) {
 121                 ksprintf(&s, ";CLR=%d", cons_llr);
 122                 if (cons_gt > 0)
 123                         ksprintf(&s, ";UGT=%c%c%c;CGT=%c%c%c", cons_gt&0xff, cons_gt>>8&0xff, cons_gt>>16&0xff,
 124                                      cons_gt>>32&0xff, cons_gt>>40&0xff, cons_gt>>48&0xff);
 125         }
 126         if (pr == 0) { // if pr is unset, return
 127                 kputc('\0', &s); kputs(b->fmt, &s); kputc('\0', &s);
 128                 free(b->str);
 129                 b->m_str = s.m; b->l_str = s.l; b->str = s.s;
 130                 bcf_sync(b);
 131                 return 1;
 132         }
 133
 134         is_var = (pr->p_ref < pref);
 135         r = is_var? pr->p_ref : pr->p_var;
 136
 137 //      ksprintf(&s, ";CI95=%.4g,%.4g", pr->cil, pr->cih); // FIXME: when EM is not used, ";" should be omitted!
 138         ksprintf(&s, ";AC1=%d", pr->ac);
 139         if (has_I16) ksprintf(&s, ";DP4=%d,%d,%d,%d;MQ=%d", a.d[0], a.d[1], a.d[2], a.d[3], a.mq);
 140         fq = pr->p_ref_folded < 0.5? -4.343 * log(pr->p_ref_folded) : 4.343 * log(pr->p_var_folded);
 141         if (fq < -999) fq = -999;
 142         if (fq > 999) fq = 999;
 143         ksprintf(&s, ";FQ=%.3g", fq);
 144         if (pr->cmp[0] >= 0.) { // two sample groups
 145                 int i, q[3];
 146                 for (i = 1; i < 3; ++i) {
 147                         double x = pr->cmp[i] + pr->cmp[0]/2.;
 148                         q[i] = x == 0? 255 : (int)(-4.343 * log(x) + .499);
 149                         if (q[i] > 255) q[i] = 255;
 150                 }
 151                 if (pr->perm_rank >= 0) ksprintf(&s, ";PR=%d", pr->perm_rank);
 152                 // ksprintf(&s, ";LRT3=%.3g", pr->lrt);
 153                 ksprintf(&s, ";PCHI2=%.3g;PC2=%d,%d", q[1], q[2], pr->p_chi2);
 154         }
 155         if (has_I16 && a.is_tested) ksprintf(&s, ";PV4=%.2g,%.2g,%.2g,%.2g", a.p[0], a.p[1], a.p[2], a.p[3]);
 156         kputc('\0', &s);
 157     rm_info(&s, "QS=");
 158     rm_info(&s, "I16=");
 159         kputs(b->fmt, &s); kputc('\0', &s);
 160         free(b->str);
 161         b->m_str = s.m; b->l_str = s.l; b->str = s.s;
 162         b->qual = r < 1e-100? 999 : -4.343 * log(r);
 163         if (b->qual > 999) b->qual = 999;
 164         bcf_sync(b);
 165         if (!is_var) bcf_shrink_alt(b, 1);
 166         else if (!(flag&VC_KEEPALT))
 167                 bcf_shrink_alt(b, pr->rank0 < 2? 2 : pr->rank0+1);
 168         if (is_var && (flag&VC_CALL_GT)) { // call individual genotype
 169                 int i, x, old_n_gi = b->n_gi;
 170                 s.m = b->m_str; s.l = b->l_str - 1; s.s = b->str;
 171                 kputs(":GT:GQ", &s); kputc('\0', &s);
 172                 b->m_str = s.m; b->l_str = s.l; b->str = s.s;
 173                 bcf_sync(b);
 174                 for (i = 0; i < b->n_smpl; ++i) {
 175                         x = bcf_p1_call_gt(pa, pr->f_exp, i);
 176                         ((uint8_t*)b->gi[old_n_gi].data)[i] = (x&3) == 0? 1<<3|1 : (x&3) == 1? 1 : 0;
 177                         ((uint8_t*)b->gi[old_n_gi+1].data)[i] = x>>2;
 178                 }
 179         }
 180         return is_var;
 181 }
 182
 183 static char **read_samples(const char *fn, int *_n)
 184 {
 185         gzFile fp;
 186         kstream_t *ks;
 187         kstring_t s;
 188         int dret, n = 0, max = 0;
 189         char **sam = 0;
 190         *_n = 0;
 191         s.l = s.m = 0; s.s = 0;
 192         fp = gzopen(fn, "r");
 193         if (fp == 0) return 0; // fail to open file
 194         ks = ks_init(fp);
 195         while (ks_getuntil(ks, 0, &s, &dret) >= 0) {
 196                 int l;
 197                 if (max == n) {
 198                         max = max? max<<1 : 4;
 199                         sam = realloc(sam, sizeof(void*)*max);
 200                 }
 201                 l = s.l;
 202                 sam[n] = malloc(s.l + 2);
 203                 strcpy(sam[n], s.s);
 204                 sam[n][l+1] = 2; // by default, diploid
 205                 if (dret != '\n') {
 206                         if (ks_getuntil(ks, 0, &s, &dret) >= 0) { // read ploidy, 1 or 2
 207                                 int x = (int)s.s[0] - '0';
 208                                 if (x == 1 || x == 2) sam[n][l+1] = x;
 209                                 else fprintf(stderr, "(%s) ploidy can only be 1 or 2; assume diploid\n", __func__);
 210                         }
 211                         if (dret != '\n') ks_getuntil(ks, '\n', &s, &dret);
 212                 }
 213                 ++n;
 214         }
 215         ks_destroy(ks);
 216         gzclose(fp);
 217         free(s.s);
 218         *_n = n;
 219         return sam;
 220 }
 221
 222 static void write_header(bcf_hdr_t *h)
 223 {
 224         kstring_t str;
 225         str.l = h->l_txt? h->l_txt - 1 : 0;
 226         str.m = str.l + 1; str.s = h->txt;
 227         if (!strstr(str.s, "##INFO=<ID=DP,"))
 228                 kputs("##INFO=<ID=DP,Number=1,Type=Integer,Description=\"Raw read depth\">\n", &str);
 229         if (!strstr(str.s, "##INFO=<ID=DP4,"))
 230                 kputs("##INFO=<ID=DP4,Number=4,Type=Integer,Description=\"# high-quality ref-forward bases, ref-reverse, alt-forward and alt-reverse bases\">\n", &str);
 231         if (!strstr(str.s, "##INFO=<ID=MQ,"))
 232                 kputs("##INFO=<ID=MQ,Number=1,Type=Integer,Description=\"Root-mean-square mapping quality of covering reads\">\n", &str);
 233         if (!strstr(str.s, "##INFO=<ID=FQ,"))
 234                 kputs("##INFO=<ID=FQ,Number=1,Type=Float,Description=\"Phred probability of all samples being the same\">\n", &str);
 235         if (!strstr(str.s, "##INFO=<ID=AF1,"))
 236                 kputs("##INFO=<ID=AF1,Number=1,Type=Float,Description=\"Max-likelihood estimate of the first ALT allele frequency (assuming HWE)\">\n", &str);
 237         if (!strstr(str.s, "##INFO=<ID=AC1,"))
 238                 kputs("##INFO=<ID=AC1,Number=1,Type=Float,Description=\"Max-likelihood estimate of the first ALT allele count (no HWE assumption)\">\n", &str);
 239         if (!strstr(str.s, "##INFO=<ID=AN,"))
 240                 kputs("##INFO=<ID=AN,Number=1,Type=Integer,Description=\"Total number of alleles in called genotypes\">\n", &str);
 241         if (!strstr(str.s, "##INFO=<ID=IS,"))
 242                 kputs("##INFO=<ID=IS,Number=2,Type=Float,Description=\"Maximum number of reads supporting an indel and fraction of indel reads\">\n", &str);
 243         if (!strstr(str.s, "##INFO=<ID=AC,"))
 244                 kputs("##INFO=<ID=AC,Number=A,Type=Integer,Description=\"Allele count in genotypes for each ALT allele, in the same order as listed\">\n", &str);
 245         if (!strstr(str.s, "##INFO=<ID=G3,"))
 246                 kputs("##INFO=<ID=G3,Number=3,Type=Float,Description=\"ML estimate of genotype frequencies\">\n", &str);
 247         if (!strstr(str.s, "##INFO=<ID=HWE,"))
 248                 kputs("##INFO=<ID=HWE,Number=1,Type=Float,Description=\"Chi^2 based HWE test P-value based on G3\">\n", &str);
 249         if (!strstr(str.s, "##INFO=<ID=CLR,"))
 250                 kputs("##INFO=<ID=CLR,Number=1,Type=Integer,Description=\"Log ratio of genotype likelihoods with and without the constraint\">\n", &str);
 251         if (!strstr(str.s, "##INFO=<ID=UGT,"))
 252                 kputs("##INFO=<ID=UGT,Number=1,Type=String,Description=\"The most probable unconstrained genotype configuration in the trio\">\n", &str);
 253         if (!strstr(str.s, "##INFO=<ID=CGT,"))
 254                 kputs("##INFO=<ID=CGT,Number=1,Type=String,Description=\"The most probable constrained genotype configuration in the trio\">\n", &str);
 255 //      if (!strstr(str.s, "##INFO=<ID=CI95,"))
 256 //              kputs("##INFO=<ID=CI95,Number=2,Type=Float,Description=\"Equal-tail Bayesian credible interval of the site allele frequency at the 95% level\">\n", &str);
 257         if (!strstr(str.s, "##INFO=<ID=PV4,"))
 258                 kputs("##INFO=<ID=PV4,Number=4,Type=Float,Description=\"P-values for strand bias, baseQ bias, mapQ bias and tail distance bias\">\n", &str);
 259     if (!strstr(str.s, "##INFO=<ID=INDEL,"))
 260         kputs("##INFO=<ID=INDEL,Number=0,Type=Flag,Description=\"Indicates that the variant is an INDEL.\">\n", &str);
 261     if (!strstr(str.s, "##INFO=<ID=PC2,"))
 262         kputs("##INFO=<ID=PC2,Number=2,Type=Integer,Description=\"Phred probability of the nonRef allele frequency in group1 samples being larger (,smaller) than in group2.\">\n", &str);
 263     if (!strstr(str.s, "##INFO=<ID=PCHI2,"))
 264         kputs("##INFO=<ID=PCHI2,Number=1,Type=Float,Description=\"Posterior weighted chi^2 P-value for testing the association between group1 and group2 samples.\">\n", &str);
 265     if (!strstr(str.s, "##INFO=<ID=QCHI2,"))
 266         kputs("##INFO=<ID=QCHI2,Number=1,Type=Integer,Description=\"Phred scaled PCHI2.\">\n", &str);
 267     if (!strstr(str.s, "##INFO=<ID=RP,"))
 268         kputs("##INFO=<ID=PR,Number=1,Type=Integer,Description=\"# permutations yielding a smaller PCHI2.\">\n", &str);
 269     if (!strstr(str.s, "##INFO=<ID=VDB,"))
 270         kputs("##INFO=<ID=VDB,Number=1,Type=Float,Description=\"Variant Distance Bias\">\n", &str);
 271     if (!strstr(str.s, "##FORMAT=<ID=GT,"))
 272         kputs("##FORMAT=<ID=GT,Number=1,Type=String,Description=\"Genotype\">\n", &str);
 273     if (!strstr(str.s, "##FORMAT=<ID=GQ,"))
 274         kputs("##FORMAT=<ID=GQ,Number=1,Type=Integer,Description=\"Genotype Quality\">\n", &str);
 275     if (!strstr(str.s, "##FORMAT=<ID=GL,"))
 276         kputs("##FORMAT=<ID=GL,Number=3,Type=Float,Description=\"Likelihoods for RR,RA,AA genotypes (R=ref,A=alt)\">\n", &str);
 277         if (!strstr(str.s, "##FORMAT=<ID=DP,"))
 278                 kputs("##FORMAT=<ID=DP,Number=1,Type=Integer,Description=\"# high-quality bases\">\n", &str);
 279         if (!strstr(str.s, "##FORMAT=<ID=DV,"))
 280                 kputs("##FORMAT=<ID=DV,Number=1,Type=Integer,Description=\"# high-quality non-reference bases\">\n", &str);
 281         if (!strstr(str.s, "##FORMAT=<ID=SP,"))
 282                 kputs("##FORMAT=<ID=SP,Number=1,Type=Integer,Description=\"Phred-scaled strand bias P-value\">\n", &str);
 283         if (!strstr(str.s, "##FORMAT=<ID=PL,"))
 284                 kputs("##FORMAT=<ID=PL,Number=G,Type=Integer,Description=\"List of Phred-scaled genotype likelihoods\">\n", &str);
 285         h->l_txt = str.l + 1; h->txt = str.s;
 286 }
 287
 288 double bcf_pair_freq(const bcf1_t *b0, const bcf1_t *b1, double f[4]);
 289
 290 int bcfview(int argc, char *argv[])
 291 {
 292         extern int bcf_2qcall(bcf_hdr_t *h, bcf1_t *b);
 293         extern void bcf_p1_indel_prior(bcf_p1aux_t *ma, double x);
 294         extern int bcf_fix_gt(bcf1_t *b);
 295         extern int bcf_anno_max(bcf1_t *b);
 296         extern int bcf_shuffle(bcf1_t *b, int seed);
 297         extern uint32_t *bcf_trio_prep(int is_x, int is_son);
 298         extern int bcf_trio_call(uint32_t *prep, const bcf1_t *b, int *llr, int64_t *gt);
 299         extern int bcf_pair_call(const bcf1_t *b);
 300         extern int bcf_min_diff(const bcf1_t *b);
 301         extern int bcf_p1_get_M(bcf_p1aux_t *b);
 302
 303         extern gzFile bcf_p1_fp_lk;
 304
 305         bcf_t *bp, *bout = 0;
 306         bcf1_t *b, *blast;
 307         int c, *seeds = 0;
 308         uint64_t n_processed = 0, qcnt[256];
 309         viewconf_t vc;
 310         bcf_p1aux_t *p1 = 0;
 311         bcf_hdr_t *hin, *hout;
 312         int tid, begin, end;
 313         char moder[4], modew[4];
 314
 315         tid = begin = end = -1;
 316         memset(&vc, 0, sizeof(viewconf_t));
 317         vc.prior_type = vc.n1 = -1; vc.theta = 1e-3; vc.pref = 0.5; vc.indel_frac = -1.; vc.n_perm = 0; vc.min_perm_p = 0.01; vc.min_smpl_frac = 0; vc.min_lrt = 1; vc.min_ma_lrt = -1;
 318         memset(qcnt, 0, 8 * 256);
 319         while ((c = getopt(argc, argv, "FN1:l:cC:eHAGvbSuP:t:p:QgLi:IMs:D:U:X:d:T:Ywm:K:")) >= 0) {
 320                 switch (c) {
 321                 case '1': vc.n1 = atoi(optarg); break;
 322                 case 'l': vc.bed = bed_read(optarg); if (!vc.bed) { fprintf(stderr,"Could not read \"%s\"\n", optarg); return 1; } break;
 323                 case 'D': vc.fn_dict = strdup(optarg); break;
 324                 case 'F': vc.flag |= VC_FIX_PL; break;
 325                 case 'N': vc.flag |= VC_ACGT_ONLY; break;
 326                 case 'G': vc.flag |= VC_NO_GENO; break;
 327                 case 'A': vc.flag |= VC_KEEPALT; break;
 328                 case 'b': vc.flag |= VC_BCFOUT; break;
 329                 case 'S': vc.flag |= VC_VCFIN; break;
 330                 case 'c': vc.flag |= VC_CALL; break;
 331                 case 'e': vc.flag |= VC_EM; break;
 332                 case 'v': vc.flag |= VC_VARONLY | VC_CALL; break;
 333                 case 'u': vc.flag |= VC_UNCOMP | VC_BCFOUT; break;
 334                 case 'g': vc.flag |= VC_CALL_GT | VC_CALL; break;
 335                 case 'I': vc.flag |= VC_NO_INDEL; break;
 336                 case 'w': vc.flag |= VC_INDEL_ONLY; break;
 337                 case 'M': vc.flag |= VC_ANNO_MAX; break;
 338                 case 'Y': vc.flag |= VC_QCNT; break;
 339         case 'm': vc.min_ma_lrt = atof(optarg); break;
 340                 case 't': vc.theta = atof(optarg); break;
 341                 case 'p': vc.pref = atof(optarg); break;
 342                 case 'i': vc.indel_frac = atof(optarg); break;
 343                 case 'Q': vc.flag |= VC_QCALL; break;
 344                 case 'L': vc.flag |= VC_ADJLD; break;
 345                 case 'U': vc.n_perm = atoi(optarg); break;
 346                 case 'C': vc.min_lrt = atof(optarg); break;
 347                 case 'X': vc.min_perm_p = atof(optarg); break;
 348                 case 'd': vc.min_smpl_frac = atof(optarg); break;
 349                 case 'K': bcf_p1_fp_lk = gzopen(optarg, "w"); break;
 350                 case 's': vc.subsam = read_samples(optarg, &vc.n_sub);
 351                         vc.ploidy = calloc(vc.n_sub + 1, 1);
 352                         for (tid = 0; tid < vc.n_sub; ++tid) vc.ploidy[tid] = vc.subsam[tid][strlen(vc.subsam[tid]) + 1];
 353                         tid = -1;
 354                         break;
 355                 case 'T':
 356                         if (strcmp(optarg, "trioauto") == 0) vc.trio_aux = bcf_trio_prep(0, 0);
 357                         else if (strcmp(optarg, "trioxd") == 0) vc.trio_aux = bcf_trio_prep(1, 0);
 358                         else if (strcmp(optarg, "trioxs") == 0) vc.trio_aux = bcf_trio_prep(1, 1);
 359                         else if (strcmp(optarg, "pair") == 0) vc.flag |= VC_PAIRCALL;
 360                         else {
 361                                 fprintf(stderr, "[%s] Option '-T' can only take value trioauto, trioxd or trioxs.\n", __func__);
 362                                 return 1;
 363                         }
 364                         break;
 365                 case 'P':
 366                         if (strcmp(optarg, "full") == 0) vc.prior_type = MC_PTYPE_FULL;
 367                         else if (strcmp(optarg, "cond2") == 0) vc.prior_type = MC_PTYPE_COND2;
 368                         else if (strcmp(optarg, "flat") == 0) vc.prior_type = MC_PTYPE_FLAT;
 369                         else vc.prior_file = strdup(optarg);
 370                         break;
 371                 }
 372         }
 373         if (argc == optind) {
 374                 fprintf(stderr, "\n");
 375                 fprintf(stderr, "Usage: bcftools view [options] <in.bcf> [reg]\n\n");
 376                 fprintf(stderr, "Input/output options:\n\n");
 377                 fprintf(stderr, "       -A        keep all possible alternate alleles at variant sites\n");
 378                 fprintf(stderr, "       -b        output BCF instead of VCF\n");
 379                 fprintf(stderr, "       -D FILE   sequence dictionary for VCF->BCF conversion [null]\n");
 380                 fprintf(stderr, "       -F        PL generated by r921 or before (which generate old ordering)\n");
 381                 fprintf(stderr, "       -G        suppress all individual genotype information\n");
 382                 fprintf(stderr, "       -l FILE   list of sites (chr pos) or regions (BED) to output [all sites]\n");
 383                 fprintf(stderr, "       -L        calculate LD for adjacent sites\n");
 384                 fprintf(stderr, "       -N        skip sites where REF is not A/C/G/T\n");
 385                 fprintf(stderr, "       -Q        output the QCALL likelihood format\n");
 386                 fprintf(stderr, "       -s FILE   list of samples to use [all samples]\n");
 387                 fprintf(stderr, "       -S        input is VCF\n");
 388                 fprintf(stderr, "       -u        uncompressed BCF output (force -b)\n");
 389                 fprintf(stderr, "\nConsensus/variant calling options:\n\n");
 390                 fprintf(stderr, "       -c        SNP calling (force -e)\n");
 391                 fprintf(stderr, "       -d FLOAT  skip loci where less than FLOAT fraction of samples covered [0]\n");
 392                 fprintf(stderr, "       -e        likelihood based analyses\n");
 393                 fprintf(stderr, "       -g        call genotypes at variant sites (force -c)\n");
 394                 fprintf(stderr, "       -i FLOAT  indel-to-substitution ratio [%.4g]\n", vc.indel_frac);
 395                 fprintf(stderr, "       -I        skip indels\n");
 396                 fprintf(stderr, "       -m FLOAT  alternative model for multiallelic and rare-variant calling, include if P(chi^2)>=FLOAT\n");
 397                 fprintf(stderr, "       -p FLOAT  variant if P(ref|D)<FLOAT [%.3g]\n", vc.pref);
 398                 fprintf(stderr, "       -P STR    type of prior: full, cond2, flat [full]\n");
 399                 fprintf(stderr, "       -t FLOAT  scaled substitution mutation rate [%.4g]\n", vc.theta);
 400                 fprintf(stderr, "       -T STR    constrained calling; STR can be: pair, trioauto, trioxd and trioxs (see manual) [null]\n");
 401                 fprintf(stderr, "       -v        output potential variant sites only (force -c)\n");
 402                 fprintf(stderr, "\nContrast calling and association test options:\n\n");
 403                 fprintf(stderr, "       -1 INT    number of group-1 samples [0]\n");
 404                 fprintf(stderr, "       -C FLOAT  posterior constrast for LRT<FLOAT and P(ref|D)<0.5 [%g]\n", vc.min_lrt);
 405                 fprintf(stderr, "       -U INT    number of permutations for association testing (effective with -1) [0]\n");
 406                 fprintf(stderr, "       -X FLOAT  only perform permutations for P(chi^2)<FLOAT [%g]\n", vc.min_perm_p);
 407                 fprintf(stderr, "\n");
 408                 return 1;
 409         }
 410
 411         if (vc.flag & VC_CALL) vc.flag |= VC_EM;
 412         if ((vc.flag & VC_VCFIN) && (vc.flag & VC_BCFOUT) && vc.fn_dict == 0) {
 413                 fprintf(stderr, "[%s] For VCF->BCF conversion please specify the sequence dictionary with -D\n", __func__);
 414                 return 1;
 415         }
 416         if (vc.n1 <= 0) vc.n_perm = 0; // TODO: give a warning here!
 417         if (vc.n_perm > 0) {
 418                 seeds = malloc(vc.n_perm * sizeof(int));
 419                 srand48(time(0));
 420                 for (c = 0; c < vc.n_perm; ++c) seeds[c] = lrand48();
 421         }
 422         b = calloc(1, sizeof(bcf1_t));
 423         blast = calloc(1, sizeof(bcf1_t));
 424         strcpy(moder, "r");
 425         if (!(vc.flag & VC_VCFIN)) strcat(moder, "b");
 426         strcpy(modew, "w");
 427         if (vc.flag & VC_BCFOUT) strcat(modew, "b");
 428         if (vc.flag & VC_UNCOMP) strcat(modew, "u");
 429         bp = vcf_open(argv[optind], moder);
 430         hin = hout = vcf_hdr_read(bp);
 431         if (vc.fn_dict && (vc.flag & VC_VCFIN))
 432                 vcf_dictread(bp, hin, vc.fn_dict);
 433         bout = vcf_open("-", modew);
 434         if (!(vc.flag & VC_QCALL)) {
 435                 if (vc.n_sub) {
 436                         vc.sublist = calloc(vc.n_sub, sizeof(int));
 437                         hout = bcf_hdr_subsam(hin, vc.n_sub, vc.subsam, vc.sublist);
 438                 }
 439                 write_header(hout); // always print the header
 440                 vcf_hdr_write(bout, hout);
 441         }
 442         if (vc.flag & VC_CALL) {
 443                 p1 = bcf_p1_init(hout->n_smpl, vc.ploidy);
 444                 if (vc.prior_file) {
 445                         if (bcf_p1_read_prior(p1, vc.prior_file) < 0) {
 446                                 fprintf(stderr, "[%s] fail to read the prior AFS.\n", __func__);
 447                                 return 1;
 448                         }
 449                 } else bcf_p1_init_prior(p1, vc.prior_type, vc.theta);
 450                 if (vc.n1 > 0 && vc.min_lrt > 0.) { // set n1
 451                         bcf_p1_set_n1(p1, vc.n1);
 452                         bcf_p1_init_subprior(p1, vc.prior_type, vc.theta);
 453                 }
 454                 if (vc.indel_frac > 0.) bcf_p1_indel_prior(p1, vc.indel_frac); // otherwise use the default indel_frac
 455         }
 456         if (optind + 1 < argc && !(vc.flag&VC_VCFIN)) {
 457                 void *str2id = bcf_build_refhash(hout);
 458                 if (bcf_parse_region(str2id, argv[optind+1], &tid, &begin, &end) >= 0) {
 459                         bcf_idx_t *idx;
 460                         idx = bcf_idx_load(argv[optind]);
 461                         if (idx) {
 462                                 uint64_t off;
 463                                 off = bcf_idx_query(idx, tid, begin);
 464                                 if (off == 0) {
 465                                         fprintf(stderr, "[%s] no records in the query region.\n", __func__);
 466                                         return 1; // FIXME: a lot of memory leaks...
 467                                 }
 468                                 bgzf_seek(bp->fp, off, SEEK_SET);
 469                                 bcf_idx_destroy(idx);
 470                         }
 471                 }
 472         }
 473         if (bcf_p1_fp_lk && p1) {
 474                 int32_t M = bcf_p1_get_M(p1);
 475                 gzwrite(bcf_p1_fp_lk, &M, 4);
 476         }
 477         while (vcf_read(bp, hin, b) > 0) {
 478                 int is_indel, cons_llr = -1;
 479                 int64_t cons_gt = -1;
 480                 double em[10];
 481                 if ((vc.flag & VC_VARONLY) && strcmp(b->alt, "X") == 0) continue;
 482                 if ((vc.flag & VC_VARONLY) && vc.min_smpl_frac > 0.) {
 483                         extern int bcf_smpl_covered(const bcf1_t *b);
 484                         int n = bcf_smpl_covered(b);
 485                         if ((double)n / b->n_smpl < vc.min_smpl_frac) continue;
 486                 }
 487                 if (vc.n_sub) bcf_subsam(vc.n_sub, vc.sublist, b);
 488                 if (vc.flag & VC_FIX_PL) bcf_fix_pl(b);
 489                 is_indel = bcf_is_indel(b);
 490                 if ((vc.flag & VC_NO_INDEL) && is_indel) continue;
 491                 if ((vc.flag & VC_INDEL_ONLY) && !is_indel) continue;
 492                 if ((vc.flag & VC_ACGT_ONLY) && !is_indel) {
 493                         int x;
 494                         if (b->ref[0] == 0 || b->ref[1] != 0) continue;
 495                         x = toupper(b->ref[0]);
 496                         if (x != 'A' && x != 'C' && x != 'G' && x != 'T') continue;
 497                 }
 498                 if (vc.bed && !bed_overlap(vc.bed, hin->ns[b->tid], b->pos, b->pos + strlen(b->ref))) continue;
 499                 if (tid >= 0) {
 500                         int l = strlen(b->ref);
 501                         l = b->pos + (l > 0? l : 1);
 502                         if (b->tid != tid || b->pos >= end) break;
 503                         if (!(l > begin && end > b->pos)) continue;
 504                 }
 505                 ++n_processed;
 506                 if ((vc.flag & VC_QCNT) && !is_indel) { // summarize the difference
 507                         int x = bcf_min_diff(b);
 508                         if (x > 255) x = 255;
 509                         if (x >= 0) ++qcnt[x];
 510                 }
 511                 if (vc.flag & VC_QCALL) { // output QCALL format; STOP here
 512                         bcf_2qcall(hout, b);
 513                         continue;
 514                 }
 515                 if (vc.trio_aux) // do trio calling
 516                         bcf_trio_call(vc.trio_aux, b, &cons_llr, &cons_gt);
 517                 else if (vc.flag & VC_PAIRCALL)
 518                         cons_llr = bcf_pair_call(b);
 519                 if (vc.flag & (VC_CALL|VC_ADJLD|VC_EM)) bcf_gl2pl(b);
 520                 if (vc.flag & VC_EM) bcf_em1(b, vc.n1, 0x1ff, em);
 521                 else {
 522                         int i;
 523                         for (i = 0; i < 9; ++i) em[i] = -1.;
 524                 }
 525         if ( !(vc.flag&VC_KEEPALT) && (vc.flag&VC_CALL) && vc.min_ma_lrt>=0 )
 526         {
 527             bcf_p1_set_ploidy(b, p1); // could be improved: do this per site to allow pseudo-autosomal regions
 528             int gts = call_multiallelic_gt(b,p1,vc.min_ma_lrt);
 529             if ( gts<=1 && vc.flag & VC_VARONLY ) continue;
 530         }
 531                 else if (vc.flag & VC_CALL) { // call variants
 532                         bcf_p1rst_t pr;
 533                         int calret;
 534                         gzwrite(bcf_p1_fp_lk, &b->tid, 4);
 535                         gzwrite(bcf_p1_fp_lk, &b->pos, 4);
 536                         gzwrite(bcf_p1_fp_lk, &em[0], sizeof(double));
 537                         calret = bcf_p1_cal(b, (em[7] >= 0 && em[7] < vc.min_lrt), p1, &pr);
 538                         if (n_processed % 100000 == 0) {
 539                                 fprintf(stderr, "[%s] %ld sites processed.\n", __func__, (long)n_processed);
 540                                 bcf_p1_dump_afs(p1);
 541                         }
 542                         if (pr.p_ref >= vc.pref && (vc.flag & VC_VARONLY)) continue;
 543                         if (vc.n_perm && vc.n1 > 0 && pr.p_chi2 < vc.min_perm_p) { // permutation test
 544                                 bcf_p1rst_t r;
 545                                 int i, n = 0;
 546                                 for (i = 0; i < vc.n_perm; ++i) {
 547 #ifdef BCF_PERM_LRT // LRT based permutation is much faster but less robust to artifacts
 548                                         double x[10];
 549                                         bcf_shuffle(b, seeds[i]);
 550                                         bcf_em1(b, vc.n1, 1<<7, x);
 551                                         if (x[7] < em[7]) ++n;
 552 #else
 553                                         bcf_shuffle(b, seeds[i]);
 554                                         bcf_p1_cal(b, 1, p1, &r);
 555                                         if (pr.p_chi2 >= r.p_chi2) ++n;
 556 #endif
 557                                 }
 558                                 pr.perm_rank = n;
 559                         }
 560                         if (calret >= 0) update_bcf1(b, p1, &pr, vc.pref, vc.flag, em, cons_llr, cons_gt);
 561                 } else if (vc.flag & VC_EM) update_bcf1(b, 0, 0, 0, vc.flag, em, cons_llr, cons_gt);
 562                 if (vc.flag & VC_ADJLD) { // compute LD
 563                         double f[4], r2;
 564                         if ((r2 = bcf_pair_freq(blast, b, f)) >= 0) {
 565                                 kstring_t s;
 566                                 s.m = s.l = 0; s.s = 0;
 567                                 if (*b->info) kputc(';', &s);
 568                                 ksprintf(&s, "NEIR=%.3f;NEIF4=%.3f,%.3f,%.3f,%.3f", r2, f[0], f[1], f[2], f[3]);
 569                                 bcf_append_info(b, s.s, s.l);
 570                                 free(s.s);
 571                         }
 572                         bcf_cpy(blast, b);
 573                 }
 574                 if (vc.flag & VC_ANNO_MAX) bcf_anno_max(b);
 575                 if (vc.flag & VC_NO_GENO) { // do not output GENO fields
 576                         b->n_gi = 0;
 577                         b->fmt[0] = '\0';
 578                         b->l_str = b->fmt - b->str + 1;
 579                 } else bcf_fix_gt(b);
 580                 vcf_write(bout, hout, b);
 581         }
 582
 583         if (bcf_p1_fp_lk) gzclose(bcf_p1_fp_lk);
 584         if (vc.prior_file) free(vc.prior_file);
 585         if (vc.flag & VC_CALL) bcf_p1_dump_afs(p1);
 586         if (hin != hout) bcf_hdr_destroy(hout);
 587         bcf_hdr_destroy(hin);
 588         bcf_destroy(b); bcf_destroy(blast);
 589         vcf_close(bp); vcf_close(bout);
 590         if (vc.fn_dict) free(vc.fn_dict);
 591         if (vc.ploidy) free(vc.ploidy);
 592         if (vc.trio_aux) free(vc.trio_aux);
 593         if (vc.n_sub) {
 594                 int i;
 595                 for (i = 0; i < vc.n_sub; ++i) free(vc.subsam[i]);
 596                 free(vc.subsam); free(vc.sublist);
 597         }
 598         if (vc.bed) bed_destroy(vc.bed);
 599         if (vc.flag & VC_QCNT)
 600                 for (c = 0; c < 256; ++c)
 601                         fprintf(stderr, "QT\t%d\t%lld\n", c, (long long)qcnt[c]);
 602         if (seeds) free(seeds);
 603         if (p1) bcf_p1_destroy(p1);
 604         return 0;
 605 }