sam/bam_plcmd.c

   1 #include <math.h>
   2 #include <stdio.h>
   3 #include <unistd.h>
   4 #include <ctype.h>
   5 #include <string.h>
   6 #include <errno.h>
   7 #include <sys/stat.h>
   8 #include <getopt.h>
   9 #include "sam.h"
  10 #include "faidx.h"
  11 #include "kstring.h"
  12 #include "sam_header.h"
  13
  14 static inline int printw(int c, FILE *fp)
  15 {
  16         char buf[16];
  17         int l, x;
  18         if (c == 0) return fputc('0', fp);
  19         for (l = 0, x = c < 0? -c : c; x > 0; x /= 10) buf[l++] = x%10 + '0';
  20         if (c < 0) buf[l++] = '-';
  21         buf[l] = 0;
  22         for (x = 0; x < l/2; ++x) {
  23                 int y = buf[x]; buf[x] = buf[l-1-x]; buf[l-1-x] = y;
  24         }
  25         fputs(buf, fp);
  26         return 0;
  27 }
  28
  29 static inline void pileup_seq(const bam_pileup1_t *p, int pos, int ref_len, const char *ref)
  30 {
  31         int j;
  32         if (p->is_head) {
  33                 putchar('^');
  34                 putchar(p->b->core.qual > 93? 126 : p->b->core.qual + 33);
  35         }
  36         if (!p->is_del) {
  37                 int c = bam_nt16_rev_table[bam1_seqi(bam1_seq(p->b), p->qpos)];
  38                 if (ref) {
  39                         int rb = pos < ref_len? ref[pos] : 'N';
  40                         if (c == '=' || bam_nt16_table[c] == bam_nt16_table[rb]) c = bam1_strand(p->b)? ',' : '.';
  41                         else c = bam1_strand(p->b)? tolower(c) : toupper(c);
  42                 } else {
  43                         if (c == '=') c = bam1_strand(p->b)? ',' : '.';
  44                         else c = bam1_strand(p->b)? tolower(c) : toupper(c);
  45                 }
  46                 putchar(c);
  47         } else putchar(p->is_refskip? (bam1_strand(p->b)? '<' : '>') : '*');
  48         if (p->indel > 0) {
  49                 putchar('+'); printw(p->indel, stdout);
  50                 for (j = 1; j <= p->indel; ++j) {
  51                         int c = bam_nt16_rev_table[bam1_seqi(bam1_seq(p->b), p->qpos + j)];
  52                         putchar(bam1_strand(p->b)? tolower(c) : toupper(c));
  53                 }
  54         } else if (p->indel < 0) {
  55                 printw(p->indel, stdout);
  56                 for (j = 1; j <= -p->indel; ++j) {
  57                         int c = (ref && (int)pos+j < ref_len)? ref[pos+j] : 'N';
  58                         putchar(bam1_strand(p->b)? tolower(c) : toupper(c));
  59                 }
  60         }
  61         if (p->is_tail) putchar('$');
  62 }
  63
  64 #include <assert.h>
  65 #include "bam2bcf.h"
  66 #include "sample.h"
  67
  68 #define MPLP_GLF   0x10
  69 #define MPLP_NO_COMP 0x20
  70 #define MPLP_NO_ORPHAN 0x40
  71 #define MPLP_REALN   0x80
  72 #define MPLP_NO_INDEL 0x400
  73 #define MPLP_REDO_BAQ 0x800
  74 #define MPLP_ILLUMINA13 0x1000
  75 #define MPLP_IGNORE_RG 0x2000
  76 #define MPLP_PRINT_POS 0x4000
  77 #define MPLP_PRINT_MAPQ 0x8000
  78 #define MPLP_PER_SAMPLE 0x10000
  79
  80 void *bed_read(const char *fn);
  81 void bed_destroy(void *_h);
  82 int bed_overlap(const void *_h, const char *chr, int beg, int end);
  83
  84 typedef struct {
  85         int max_mq, min_mq, flag, min_baseQ, capQ_thres, max_depth, max_indel_depth, fmt_flag;
  86     int rflag_require, rflag_filter;
  87         int openQ, extQ, tandemQ, min_support; // for indels
  88         double min_frac; // for indels
  89         char *reg, *pl_list, *fai_fname;
  90         faidx_t *fai;
  91         void *bed, *rghash;
  92 } mplp_conf_t;
  93
  94 typedef struct {
  95         bamFile fp;
  96         bam_iter_t iter;
  97         bam_header_t *h;
  98         int ref_id;
  99         char *ref;
 100         const mplp_conf_t *conf;
 101 } mplp_aux_t;
 102
 103 typedef struct {
 104         int n;
 105         int *n_plp, *m_plp;
 106         bam_pileup1_t **plp;
 107 } mplp_pileup_t;
 108
 109 static int mplp_func(void *data, bam1_t *b)
 110 {
 111         extern int bam_realn(bam1_t *b, const char *ref);
 112         extern int bam_prob_realn_core(bam1_t *b, const char *ref, int);
 113         extern int bam_cap_mapQ(bam1_t *b, char *ref, int thres);
 114         mplp_aux_t *ma = (mplp_aux_t*)data;
 115         int ret, skip = 0;
 116         do {
 117                 int has_ref;
 118                 ret = ma->iter? bam_iter_read(ma->fp, ma->iter, b) : bam_read1(ma->fp, b);
 119                 if (ret < 0) break;
 120                 if (b->core.tid < 0 || (b->core.flag&BAM_FUNMAP)) { // exclude unmapped reads
 121                         skip = 1;
 122                         continue;
 123                 }
 124         if (ma->conf->rflag_require && !(ma->conf->rflag_require&b->core.flag)) { skip = 1; continue; }
 125         if (ma->conf->rflag_filter && ma->conf->rflag_filter&b->core.flag) { skip = 1; continue; }
 126                 if (ma->conf->bed) { // test overlap
 127                         skip = !bed_overlap(ma->conf->bed, ma->h->target_name[b->core.tid], b->core.pos, bam_calend(&b->core, bam1_cigar(b)));
 128                         if (skip) continue;
 129                 }
 130                 if (ma->conf->rghash) { // exclude read groups
 131                         uint8_t *rg = bam_aux_get(b, "RG");
 132                         skip = (rg && bcf_str2id(ma->conf->rghash, (const char*)(rg+1)) >= 0);
 133                         if (skip) continue;
 134                 }
 135                 if (ma->conf->flag & MPLP_ILLUMINA13) {
 136                         int i;
 137                         uint8_t *qual = bam1_qual(b);
 138                         for (i = 0; i < b->core.l_qseq; ++i)
 139                                 qual[i] = qual[i] > 31? qual[i] - 31 : 0;
 140                 }
 141                 has_ref = (ma->ref && ma->ref_id == b->core.tid)? 1 : 0;
 142                 skip = 0;
 143                 if (has_ref && (ma->conf->flag&MPLP_REALN)) bam_prob_realn_core(b, ma->ref, (ma->conf->flag & MPLP_REDO_BAQ)? 7 : 3);
 144                 if (has_ref && ma->conf->capQ_thres > 10) {
 145                         int q = bam_cap_mapQ(b, ma->ref, ma->conf->capQ_thres);
 146                         if (q < 0) skip = 1;
 147                         else if (b->core.qual > q) b->core.qual = q;
 148                 }
 149                 else if (b->core.qual < ma->conf->min_mq) skip = 1;
 150                 else if ((ma->conf->flag&MPLP_NO_ORPHAN) && (b->core.flag&1) && !(b->core.flag&2)) skip = 1;
 151         } while (skip);
 152         return ret;
 153 }
 154
 155 static void group_smpl(mplp_pileup_t *m, bam_sample_t *sm, kstring_t *buf,
 156                                            int n, char *const*fn, int *n_plp, const bam_pileup1_t **plp, int ignore_rg)
 157 {
 158         int i, j;
 159         memset(m->n_plp, 0, m->n * sizeof(int));
 160         for (i = 0; i < n; ++i) {
 161                 for (j = 0; j < n_plp[i]; ++j) {
 162                         const bam_pileup1_t *p = plp[i] + j;
 163                         uint8_t *q;
 164                         int id = -1;
 165                         q = ignore_rg? 0 : bam_aux_get(p->b, "RG");
 166                         if (q) id = bam_smpl_rg2smid(sm, fn[i], (char*)q+1, buf);
 167                         if (id < 0) id = bam_smpl_rg2smid(sm, fn[i], 0, buf);
 168                         if (id < 0 || id >= m->n) {
 169                                 assert(q); // otherwise a bug
 170                                 fprintf(stderr, "[%s] Read group %s used in file %s but absent from the header or an alignment missing read group.\n", __func__, (char*)q+1, fn[i]);
 171                                 exit(1);
 172                         }
 173                         if (m->n_plp[id] == m->m_plp[id]) {
 174                                 m->m_plp[id] = m->m_plp[id]? m->m_plp[id]<<1 : 8;
 175                                 m->plp[id] = realloc(m->plp[id], sizeof(bam_pileup1_t) * m->m_plp[id]);
 176                         }
 177                         m->plp[id][m->n_plp[id]++] = *p;
 178                 }
 179         }
 180 }
 181
 182 static int mpileup(mplp_conf_t *conf, int n, char **fn)
 183 {
 184         extern void *bcf_call_add_rg(void *rghash, const char *hdtext, const char *list);
 185         extern void bcf_call_del_rghash(void *rghash);
 186         mplp_aux_t **data;
 187         int i, tid, pos, *n_plp, tid0 = -1, beg0 = 0, end0 = 1u<<29, ref_len, ref_tid = -1, max_depth, max_indel_depth;
 188         const bam_pileup1_t **plp;
 189         bam_mplp_t iter;
 190         bam_header_t *h = 0;
 191         char *ref;
 192         void *rghash = 0;
 193
 194         bcf_callaux_t *bca = 0;
 195         bcf_callret1_t *bcr = 0;
 196         bcf_call_t bc;
 197         bcf_t *bp = 0;
 198         bcf_hdr_t *bh = 0;
 199
 200         bam_sample_t *sm = 0;
 201         kstring_t buf;
 202         mplp_pileup_t gplp;
 203
 204         memset(&gplp, 0, sizeof(mplp_pileup_t));
 205         memset(&buf, 0, sizeof(kstring_t));
 206         memset(&bc, 0, sizeof(bcf_call_t));
 207         data = calloc(n, sizeof(void*));
 208         plp = calloc(n, sizeof(void*));
 209         n_plp = calloc(n, sizeof(int*));
 210         sm = bam_smpl_init();
 211
 212         // read the header and initialize data
 213         for (i = 0; i < n; ++i) {
 214                 bam_header_t *h_tmp;
 215                 data[i] = calloc(1, sizeof(mplp_aux_t));
 216                 data[i]->fp = strcmp(fn[i], "-") == 0? bam_dopen(fileno(stdin), "r") : bam_open(fn[i], "r");
 217         if ( !data[i]->fp )
 218         {
 219             fprintf(stderr, "[%s] failed to open %s: %s\n", __func__, fn[i], strerror(errno));
 220             exit(1);
 221         }
 222                 data[i]->conf = conf;
 223                 h_tmp = bam_header_read(data[i]->fp);
 224         if ( !h_tmp ) {
 225             fprintf(stderr,"[%s] fail to read the header of %s\n", __func__, fn[i]);
 226             exit(1);
 227         }
 228                 data[i]->h = i? h : h_tmp; // for i==0, "h" has not been set yet
 229                 bam_smpl_add(sm, fn[i], (conf->flag&MPLP_IGNORE_RG)? 0 : h_tmp->text);
 230                 rghash = bcf_call_add_rg(rghash, h_tmp->text, conf->pl_list);
 231                 if (conf->reg) {
 232                         int beg, end;
 233                         bam_index_t *idx;
 234                         idx = bam_index_load(fn[i]);
 235                         if (idx == 0) {
 236                                 fprintf(stderr, "[%s] fail to load index for %s\n", __func__, fn[i]);
 237                                 exit(1);
 238                         }
 239                         if (bam_parse_region(h_tmp, conf->reg, &tid, &beg, &end) < 0) {
 240                                 fprintf(stderr, "[%s] malformatted region or wrong seqname for %s\n", __func__, fn[i]);
 241                                 exit(1);
 242                         }
 243                         if (i == 0) tid0 = tid, beg0 = beg, end0 = end;
 244                         data[i]->iter = bam_iter_query(idx, tid, beg, end);
 245                         bam_index_destroy(idx);
 246                 }
 247                 if (i == 0) h = h_tmp;
 248                 else {
 249                         // FIXME: to check consistency
 250                         bam_header_destroy(h_tmp);
 251                 }
 252         }
 253         gplp.n = sm->n;
 254         gplp.n_plp = calloc(sm->n, sizeof(int));
 255         gplp.m_plp = calloc(sm->n, sizeof(int));
 256         gplp.plp = calloc(sm->n, sizeof(void*));
 257
 258         fprintf(stderr, "[%s] %d samples in %d input files\n", __func__, sm->n, n);
 259         // write the VCF header
 260         if (conf->flag & MPLP_GLF) {
 261                 kstring_t s;
 262                 bh = calloc(1, sizeof(bcf_hdr_t));
 263                 s.l = s.m = 0; s.s = 0;
 264                 bp = bcf_open("-", (conf->flag&MPLP_NO_COMP)? "wu" : "w");
 265                 for (i = 0; i < h->n_targets; ++i) {
 266                         kputs(h->target_name[i], &s);
 267                         kputc('\0', &s);
 268                 }
 269                 bh->l_nm = s.l;
 270                 bh->name = malloc(s.l);
 271                 memcpy(bh->name, s.s, s.l);
 272                 s.l = 0;
 273                 for (i = 0; i < sm->n; ++i) {
 274                         kputs(sm->smpl[i], &s); kputc('\0', &s);
 275                 }
 276                 bh->l_smpl = s.l;
 277                 bh->sname = malloc(s.l);
 278                 memcpy(bh->sname, s.s, s.l);
 279         s.l = 0;
 280         ksprintf(&s, "##samtoolsVersion=%s\n", BAM_VERSION);
 281         if (conf->fai_fname) ksprintf(&s, "##reference=file://%s\n", conf->fai_fname);
 282         h->dict = sam_header_parse2(h->text);
 283         int nseq;
 284         const char *tags[] = {"SN","LN","UR","M5",NULL};
 285         char **tbl = sam_header2tbl_n(h->dict, "SQ", tags, &nseq);
 286         for (i=0; i<nseq; i++)
 287         {
 288             ksprintf(&s, "##contig=<ID=%s", tbl[4*i]);
 289             if ( tbl[4*i+1] ) ksprintf(&s, ",length=%s", tbl[4*i+1]);
 290             if ( tbl[4*i+2] ) ksprintf(&s, ",URL=%s", tbl[4*i+2]);
 291             if ( tbl[4*i+3] ) ksprintf(&s, ",md5=%s", tbl[4*i+3]);
 292             kputs(">\n", &s);
 293         }
 294         if (tbl) free(tbl);
 295                 bh->txt = s.s;
 296                 bh->l_txt = 1 + s.l;
 297                 bcf_hdr_sync(bh);
 298                 bcf_hdr_write(bp, bh);
 299                 bca = bcf_call_init(-1., conf->min_baseQ);
 300                 bcr = calloc(sm->n, sizeof(bcf_callret1_t));
 301                 bca->rghash = rghash;
 302                 bca->openQ = conf->openQ, bca->extQ = conf->extQ, bca->tandemQ = conf->tandemQ;
 303                 bca->min_frac = conf->min_frac;
 304                 bca->min_support = conf->min_support;
 305         bca->per_sample_flt = conf->flag & MPLP_PER_SAMPLE;
 306         }
 307         if (tid0 >= 0 && conf->fai) { // region is set
 308                 ref = faidx_fetch_seq(conf->fai, h->target_name[tid0], 0, 0x7fffffff, &ref_len);
 309                 ref_tid = tid0;
 310                 for (i = 0; i < n; ++i) data[i]->ref = ref, data[i]->ref_id = tid0;
 311         } else ref_tid = -1, ref = 0;
 312         iter = bam_mplp_init(n, mplp_func, (void**)data);
 313         max_depth = conf->max_depth;
 314         if (max_depth * sm->n > 1<<20)
 315                 fprintf(stderr, "(%s) Max depth is above 1M. Potential memory hog!\n", __func__);
 316         if (max_depth * sm->n < 8000) {
 317                 max_depth = 8000 / sm->n;
 318                 fprintf(stderr, "<%s> Set max per-file depth to %d\n", __func__, max_depth);
 319         }
 320         max_indel_depth = conf->max_indel_depth * sm->n;
 321         bam_mplp_set_maxcnt(iter, max_depth);
 322         while (bam_mplp_auto(iter, &tid, &pos, n_plp, plp) > 0) {
 323                 if (conf->reg && (pos < beg0 || pos >= end0)) continue; // out of the region requested
 324                 if (conf->bed && tid >= 0 && !bed_overlap(conf->bed, h->target_name[tid], pos, pos+1)) continue;
 325                 if (tid != ref_tid) {
 326                         free(ref); ref = 0;
 327                         if (conf->fai) ref = faidx_fetch_seq(conf->fai, h->target_name[tid], 0, 0x7fffffff, &ref_len);
 328                         for (i = 0; i < n; ++i) data[i]->ref = ref, data[i]->ref_id = tid;
 329                         ref_tid = tid;
 330                 }
 331                 if (conf->flag & MPLP_GLF) {
 332                         int total_depth, _ref0, ref16;
 333                         bcf1_t *b = calloc(1, sizeof(bcf1_t));
 334                         for (i = total_depth = 0; i < n; ++i) total_depth += n_plp[i];
 335                         group_smpl(&gplp, sm, &buf, n, fn, n_plp, plp, conf->flag & MPLP_IGNORE_RG);
 336                         _ref0 = (ref && pos < ref_len)? ref[pos] : 'N';
 337                         ref16 = bam_nt16_table[_ref0];
 338                         for (i = 0; i < gplp.n; ++i)
 339                                 bcf_call_glfgen(gplp.n_plp[i], gplp.plp[i], ref16, bca, bcr + i);
 340                         bcf_call_combine(gplp.n, bcr, bca, ref16, &bc);
 341                         bcf_call2bcf(tid, pos, &bc, b, bcr, conf->fmt_flag, 0, 0);
 342                         bcf_write(bp, bh, b);
 343                         bcf_destroy(b);
 344                         // call indels
 345                         if (!(conf->flag&MPLP_NO_INDEL) && total_depth < max_indel_depth && bcf_call_gap_prep(gplp.n, gplp.n_plp, gplp.plp, pos, bca, ref, rghash) >= 0) {
 346                                 for (i = 0; i < gplp.n; ++i)
 347                                         bcf_call_glfgen(gplp.n_plp[i], gplp.plp[i], -1, bca, bcr + i);
 348                                 if (bcf_call_combine(gplp.n, bcr, bca, -1, &bc) >= 0) {
 349                                         b = calloc(1, sizeof(bcf1_t));
 350                                         bcf_call2bcf(tid, pos, &bc, b, bcr, conf->fmt_flag, bca, ref);
 351                                         bcf_write(bp, bh, b);
 352                                         bcf_destroy(b);
 353                                 }
 354                         }
 355                 } else {
 356                         printf("%s\t%d\t%c", h->target_name[tid], pos + 1, (ref && pos < ref_len)? ref[pos] : 'N');
 357                         for (i = 0; i < n; ++i) {
 358                                 int j, cnt;
 359                                 for (j = cnt = 0; j < n_plp[i]; ++j) {
 360                                         const bam_pileup1_t *p = plp[i] + j;
 361                                         if (bam1_qual(p->b)[p->qpos] >= conf->min_baseQ) ++cnt;
 362                                 }
 363                                 printf("\t%d\t", cnt);
 364                                 if (n_plp[i] == 0) {
 365                                         printf("*\t*"); // FIXME: printf() is very slow...
 366                                         if (conf->flag & MPLP_PRINT_POS) printf("\t*");
 367                                 } else {
 368                                         for (j = 0; j < n_plp[i]; ++j) {
 369                                                 const bam_pileup1_t *p = plp[i] + j;
 370                                                 if (bam1_qual(p->b)[p->qpos] >= conf->min_baseQ)
 371                                                         pileup_seq(plp[i] + j, pos, ref_len, ref);
 372                                         }
 373                                         putchar('\t');
 374                                         for (j = 0; j < n_plp[i]; ++j) {
 375                                                 const bam_pileup1_t *p = plp[i] + j;
 376                                                 int c = bam1_qual(p->b)[p->qpos];
 377                                                 if (c >= conf->min_baseQ) {
 378                                                         c = c + 33 < 126? c + 33 : 126;
 379                                                         putchar(c);
 380                                                 }
 381                                         }
 382                                         if (conf->flag & MPLP_PRINT_MAPQ) {
 383                                                 putchar('\t');
 384                                                 for (j = 0; j < n_plp[i]; ++j) {
 385                                                         int c = plp[i][j].b->core.qual + 33;
 386                                                         if (c > 126) c = 126;
 387                                                         putchar(c);
 388                                                 }
 389                                         }
 390                                         if (conf->flag & MPLP_PRINT_POS) {
 391                                                 putchar('\t');
 392                                                 for (j = 0; j < n_plp[i]; ++j) {
 393                                                         if (j > 0) putchar(',');
 394                                                         printf("%d", plp[i][j].qpos + 1); // FIXME: printf() is very slow...
 395                                                 }
 396                                         }
 397                                 }
 398                         }
 399                         putchar('\n');
 400                 }
 401         }
 402
 403         bcf_close(bp);
 404         bam_smpl_destroy(sm); free(buf.s);
 405         for (i = 0; i < gplp.n; ++i) free(gplp.plp[i]);
 406         free(gplp.plp); free(gplp.n_plp); free(gplp.m_plp);
 407         bcf_call_del_rghash(rghash);
 408         bcf_hdr_destroy(bh); bcf_call_destroy(bca); free(bc.PL); free(bcr);
 409         bam_mplp_destroy(iter);
 410         bam_header_destroy(h);
 411         for (i = 0; i < n; ++i) {
 412                 bam_close(data[i]->fp);
 413                 if (data[i]->iter) bam_iter_destroy(data[i]->iter);
 414                 free(data[i]);
 415         }
 416         free(data); free(plp); free(ref); free(n_plp);
 417         return 0;
 418 }
 419
 420 #define MAX_PATH_LEN 1024
 421 int read_file_list(const char *file_list,int *n,char **argv[])
 422 {
 423     char buf[MAX_PATH_LEN];
 424     int len, nfiles = 0;
 425     char **files = NULL;
 426     struct stat sb;
 427
 428     *n = 0;
 429     *argv = NULL;
 430
 431     FILE *fh = fopen(file_list,"r");
 432     if ( !fh )
 433     {
 434         fprintf(stderr,"%s: %s\n", file_list,strerror(errno));
 435         return 1;
 436     }
 437
 438     files = calloc(nfiles,sizeof(char*));
 439     nfiles = 0;
 440     while ( fgets(buf,MAX_PATH_LEN,fh) )
 441     {
 442         // allow empty lines and trailing spaces
 443         len = strlen(buf);
 444         while ( len>0 && isspace(buf[len-1]) ) len--;
 445         if ( !len ) continue;
 446
 447         // check sanity of the file list
 448         buf[len] = 0;
 449         if (stat(buf, &sb) != 0)
 450         {
 451             // no such file, check if it is safe to print its name
 452             int i, safe_to_print = 1;
 453             for (i=0; i<len; i++)
 454                 if (!isprint(buf[i])) { safe_to_print = 0; break; }
 455             if ( safe_to_print )
 456                 fprintf(stderr,"The file list \"%s\" appears broken, could not locate: %s\n", file_list,buf);
 457             else
 458                 fprintf(stderr,"Does the file \"%s\" really contain a list of files and do all exist?\n", file_list);
 459             return 1;
 460         }
 461
 462         nfiles++;
 463         files = realloc(files,nfiles*sizeof(char*));
 464         files[nfiles-1] = strdup(buf);
 465     }
 466     fclose(fh);
 467     if ( !nfiles )
 468     {
 469         fprintf(stderr,"No files read from %s\n", file_list);
 470         return 1;
 471     }
 472     *argv = files;
 473     *n    = nfiles;
 474     return 0;
 475 }
 476 #undef MAX_PATH_LEN
 477
 478 int bam_mpileup(int argc, char *argv[])
 479 {
 480         int c;
 481     const char *file_list = NULL;
 482     char **fn = NULL;
 483     int nfiles = 0, use_orphan = 0;
 484         mplp_conf_t mplp;
 485         memset(&mplp, 0, sizeof(mplp_conf_t));
 486         mplp.max_mq = 60;
 487         mplp.min_baseQ = 13;
 488         mplp.capQ_thres = 0;
 489         mplp.max_depth = 250; mplp.max_indel_depth = 250;
 490         mplp.openQ = 40; mplp.extQ = 20; mplp.tandemQ = 100;
 491         mplp.min_frac = 0.002; mplp.min_support = 1;
 492         mplp.flag = MPLP_NO_ORPHAN | MPLP_REALN;
 493     static struct option lopts[] =
 494     {
 495         {"rf",1,0,1},   // require flag
 496         {"ff",1,0,2},   // filter flag
 497         {0,0,0,0}
 498     };
 499         while ((c = getopt_long(argc, argv, "Agf:r:l:M:q:Q:uaRC:BDSd:L:b:P:po:e:h:Im:F:EG:6OsV1:2:",lopts,NULL)) >= 0) {
 500                 switch (c) {
 501         case  1 : mplp.rflag_require = strtol(optarg,0,0); break;
 502         case  2 : mplp.rflag_filter  = strtol(optarg,0,0); break;
 503                 case 'f':
 504                         mplp.fai = fai_load(optarg);
 505                         if (mplp.fai == 0) return 1;
 506             mplp.fai_fname = optarg;
 507                         break;
 508                 case 'd': mplp.max_depth = atoi(optarg); break;
 509                 case 'r': mplp.reg = strdup(optarg); break;
 510                 case 'l': mplp.bed = bed_read(optarg); break;
 511                 case 'P': mplp.pl_list = strdup(optarg); break;
 512                 case 'p': mplp.flag |= MPLP_PER_SAMPLE; break;
 513                 case 'g': mplp.flag |= MPLP_GLF; break;
 514                 case 'u': mplp.flag |= MPLP_NO_COMP | MPLP_GLF; break;
 515                 case 'a': mplp.flag |= MPLP_NO_ORPHAN | MPLP_REALN; break;
 516                 case 'B': mplp.flag &= ~MPLP_REALN; break;
 517                 case 'D': mplp.fmt_flag |= B2B_FMT_DP; break;
 518                 case 'S': mplp.fmt_flag |= B2B_FMT_SP; break;
 519                 case 'V': mplp.fmt_flag |= B2B_FMT_DV; break;
 520                 case 'I': mplp.flag |= MPLP_NO_INDEL; break;
 521                 case 'E': mplp.flag |= MPLP_REDO_BAQ; break;
 522                 case '6': mplp.flag |= MPLP_ILLUMINA13; break;
 523                 case 'R': mplp.flag |= MPLP_IGNORE_RG; break;
 524                 case 's': mplp.flag |= MPLP_PRINT_MAPQ; break;
 525                 case 'O': mplp.flag |= MPLP_PRINT_POS; break;
 526                 case 'C': mplp.capQ_thres = atoi(optarg); break;
 527                 case 'M': mplp.max_mq = atoi(optarg); break;
 528                 case 'q': mplp.min_mq = atoi(optarg); break;
 529                 case 'Q': mplp.min_baseQ = atoi(optarg); break;
 530         case 'b': file_list = optarg; break;
 531                 case 'o': mplp.openQ = atoi(optarg); break;
 532                 case 'e': mplp.extQ = atoi(optarg); break;
 533                 case 'h': mplp.tandemQ = atoi(optarg); break;
 534                 case 'A': use_orphan = 1; break;
 535                 case 'F': mplp.min_frac = atof(optarg); break;
 536                 case 'm': mplp.min_support = atoi(optarg); break;
 537                 case 'L': mplp.max_indel_depth = atoi(optarg); break;
 538                 case 'G': {
 539                                 FILE *fp_rg;
 540                                 char buf[1024];
 541                                 mplp.rghash = bcf_str2id_init();
 542                                 if ((fp_rg = fopen(optarg, "r")) == 0)
 543                                         fprintf(stderr, "(%s) Fail to open file %s. Continue anyway.\n", __func__, optarg);
 544                                 while (!feof(fp_rg) && fscanf(fp_rg, "%s", buf) > 0) // this is not a good style, but forgive me...
 545                                         bcf_str2id_add(mplp.rghash, strdup(buf));
 546                                 fclose(fp_rg);
 547                         }
 548                         break;
 549                 }
 550         }
 551         if (use_orphan) mplp.flag &= ~MPLP_NO_ORPHAN;
 552         if (argc == 1) {
 553                 fprintf(stderr, "\n");
 554                 fprintf(stderr, "Usage: samtools mpileup [options] in1.bam [in2.bam [...]]\n\n");
 555                 fprintf(stderr, "Input options:\n\n");
 556                 fprintf(stderr, "       -6           assume the quality is in the Illumina-1.3+ encoding\n");
 557                 fprintf(stderr, "       -A           count anomalous read pairs\n");
 558                 fprintf(stderr, "       -B           disable BAQ computation\n");
 559                 fprintf(stderr, "       -b FILE      list of input BAM filenames, one per line [null]\n");
 560                 fprintf(stderr, "       -C INT       parameter for adjusting mapQ; 0 to disable [0]\n");
 561                 fprintf(stderr, "       -d INT       max per-BAM depth to avoid excessive memory usage [%d]\n", mplp.max_depth);
 562                 fprintf(stderr, "       -E           recalculate extended BAQ on the fly thus ignoring existing BQs\n");
 563                 fprintf(stderr, "       -f FILE      faidx indexed reference sequence file [null]\n");
 564                 fprintf(stderr, "       -G FILE      exclude read groups listed in FILE [null]\n");
 565                 fprintf(stderr, "       -l FILE      list of positions (chr pos) or regions (BED) [null]\n");
 566                 fprintf(stderr, "       -M INT       cap mapping quality at INT [%d]\n", mplp.max_mq);
 567                 fprintf(stderr, "       -r STR       region in which pileup is generated [null]\n");
 568                 fprintf(stderr, "       -R           ignore RG tags\n");
 569                 fprintf(stderr, "       -q INT       skip alignments with mapQ smaller than INT [%d]\n", mplp.min_mq);
 570                 fprintf(stderr, "       -Q INT       skip bases with baseQ/BAQ smaller than INT [%d]\n", mplp.min_baseQ);
 571                 fprintf(stderr, "       --rf INT     required flags: skip reads with mask bits unset []\n");
 572                 fprintf(stderr, "       --ff INT     filter flags: skip reads with mask bits set []\n");
 573                 fprintf(stderr, "\nOutput options:\n\n");
 574                 fprintf(stderr, "       -D           output per-sample DP in BCF (require -g/-u)\n");
 575                 fprintf(stderr, "       -g           generate BCF output (genotype likelihoods)\n");
 576                 fprintf(stderr, "       -O           output base positions on reads (disabled by -g/-u)\n");
 577                 fprintf(stderr, "       -s           output mapping quality (disabled by -g/-u)\n");
 578                 fprintf(stderr, "       -S           output per-sample strand bias P-value in BCF (require -g/-u)\n");
 579                 fprintf(stderr, "       -u           generate uncompress BCF output\n");
 580                 fprintf(stderr, "\nSNP/INDEL genotype likelihoods options (effective with `-g' or `-u'):\n\n");
 581                 fprintf(stderr, "       -e INT       Phred-scaled gap extension seq error probability [%d]\n", mplp.extQ);
 582                 fprintf(stderr, "       -F FLOAT     minimum fraction of gapped reads for candidates [%g]\n", mplp.min_frac);
 583                 fprintf(stderr, "       -h INT       coefficient for homopolymer errors [%d]\n", mplp.tandemQ);
 584                 fprintf(stderr, "       -I           do not perform indel calling\n");
 585                 fprintf(stderr, "       -L INT       max per-sample depth for INDEL calling [%d]\n", mplp.max_indel_depth);
 586                 fprintf(stderr, "       -m INT       minimum gapped reads for indel candidates [%d]\n", mplp.min_support);
 587                 fprintf(stderr, "       -o INT       Phred-scaled gap open sequencing error probability [%d]\n", mplp.openQ);
 588                 fprintf(stderr, "       -p           apply -m and -F per-sample to increase sensitivity\n");
 589                 fprintf(stderr, "       -P STR       comma separated list of platforms for indels [all]\n");
 590                 fprintf(stderr, "\n");
 591                 fprintf(stderr, "Notes: Assuming diploid individuals.\n\n");
 592                 return 1;
 593         }
 594         bam_no_B = 1;
 595     if (file_list) {
 596         if ( read_file_list(file_list,&nfiles,&fn) ) return 1;
 597         mpileup(&mplp,nfiles,fn);
 598         for (c=0; c<nfiles; c++) free(fn[c]);
 599         free(fn);
 600     } else mpileup(&mplp, argc - optind, argv + optind);
 601         if (mplp.rghash) bcf_str2id_thorough_destroy(mplp.rghash);
 602         free(mplp.reg); free(mplp.pl_list);
 603         if (mplp.fai) fai_destroy(mplp.fai);
 604         if (mplp.bed) bed_destroy(mplp.bed);
 605         return 0;
 606 }