bam_maqcns.c

   1 #include <math.h>
   2 #include "bam.h"
   3 #include "bam_maqcns.h"
   4 #include "ksort.h"
   5 KSORT_INIT_GENERIC(uint32_t)
   6
   7 #define MAX_WINDOW 33
   8
   9 typedef struct __bmc_aux_t {
  10         int max;
  11         uint32_t *info;
  12 } bmc_aux_t;
  13
  14 typedef struct {
  15         float esum[4], fsum[4];
  16         uint32_t c[4];
  17         uint32_t mapQ_max;
  18 } glf_call_aux_t;
  19
  20 char bam_nt16_nt4_table[] = { 4, 0, 1, 4, 2, 4, 4, 4, 3, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4 };
  21
  22 /*
  23   P(<b1,b2>) = \theta \sum_{i=1}^{N-1} 1/i
  24   P(D|<b1,b2>) = \sum_{k=1}^{N-1} p_k 1/2 [(k/N)^n_2(1-k/N)^n_1 + (k/N)^n1(1-k/N)^n_2]
  25   p_k = i/k / \sum_{i=1}^{N-1} 1/i
  26  */
  27 static void cal_het(bam_maqcns_t *aa)
  28 {
  29         int k, n1, n2;
  30         double sum_harmo; // harmonic sum
  31         double poly_rate;
  32         double p1 = 0.0, p3 = 0.0; // just for testing
  33
  34         free(aa->lhet);
  35         aa->lhet = (double*)calloc(256 * 256, sizeof(double));
  36         sum_harmo = 0.0;
  37         for (k = 1; k <= aa->n_hap - 1; ++k)
  38                 sum_harmo += 1.0 / k;
  39         for (n1 = 0; n1 < 256; ++n1) {
  40                 for (n2 = 0; n2 < 256; ++n2) {
  41                         long double sum = 0.0;
  42                         double lC = lgamma(n1+n2+1) - lgamma(n1+1) - lgamma(n2+1); // \binom{n1+n2}{n1}
  43                         for (k = 1; k <= aa->n_hap - 1; ++k) {
  44                                 double pk = 1.0 / k / sum_harmo;
  45                                 double log1 = log((double)k/aa->n_hap);
  46                                 double log2 = log(1.0 - (double)k/aa->n_hap);
  47                                 sum += pk * 0.5 * (expl(log1*n2) * expl(log2*n1) + expl(log1*n1) * expl(log2*n2));
  48                         }
  49                         aa->lhet[n1<<8|n2] = lC + logl(sum);
  50                         if (n1 == 17 && n2 == 3) p3 = lC + logl(expl(logl(0.5) * 20));
  51                         if (n1 == 19 && n2 == 1) p1 = lC + logl(expl(logl(0.5) * 20));
  52                 }
  53         }
  54         poly_rate = aa->het_rate * sum_harmo;
  55         aa->q_r = -4.343 * log(2.0 * poly_rate / (1.0 - poly_rate));
  56 }
  57
  58 /** initialize the helper structure */
  59 static void cal_coef(bam_maqcns_t *aa)
  60 {
  61         int k, n, q;
  62         long double sum_a[257], b[256], q_c[256], tmp[256], fk2[256];
  63         double *lC;
  64
  65         lC = (double*)calloc(256 * 256, sizeof(double));
  66         // aa->lhet will be allocated and initialized
  67         free(aa->fk); free(aa->coef);
  68         aa->fk = (double*)calloc(256, sizeof(double));
  69         aa->coef = (double*)calloc(256*256*64, sizeof(double));
  70         aa->fk[0] = fk2[0] = 1.0;
  71         for (n = 1; n != 256; ++n) {
  72                 aa->fk[n] = pow(aa->theta, n) * (1.0 - aa->eta) + aa->eta;
  73                 fk2[n] = aa->fk[n>>1]; // this is an approximation, assuming reads equally likely come from both strands
  74         }
  75         for (n = 1; n != 256; ++n)
  76                 for (k = 1; k <= n; ++k)
  77                         lC[n<<8|k] = lgamma(n+1) - lgamma(k+1) - lgamma(n-k+1);
  78         for (q = 1; q != 64; ++q) {
  79                 double e = pow(10.0, -q/10.0);
  80                 double le = log(e);
  81                 double le1 = log(1.0-e);
  82                 for (n = 1; n != 256; ++n) {
  83                         double *coef = aa->coef + (q<<16|n<<8);
  84                         sum_a[n+1] = 0.0;
  85                         for (k = n; k >= 0; --k) { // a_k = \sum_{i=k}^n C^n_k \epsilon^k (1-\epsilon)^{n-k}
  86                                 sum_a[k] = sum_a[k+1] + expl(lC[n<<8|k] + k*le + (n-k)*le1);
  87                                 b[k] = sum_a[k+1] / sum_a[k];
  88                                 if (b[k] > 0.99) b[k] = 0.99;
  89                         }
  90                         for (k = 0; k != n; ++k) // log(\bar\beta_{nk}(\bar\epsilon)^{f_k})
  91                                 q_c[k] = -4.343 * fk2[k] * logl(b[k] / e);
  92                         for (k = 1; k != n; ++k) q_c[k] += q_c[k-1]; // \prod_{i=0}^k c_i
  93                         for (k = 0; k <= n; ++k) { // powl() in 64-bit mode seems broken on my Mac OS X 10.4.9
  94                                 tmp[k] = -4.343 * logl(1.0 - expl(fk2[k] * logl(b[k])));
  95                                 coef[k] = (k? q_c[k-1] : 0) + tmp[k]; // this is the final c_{nk}
  96                         }
  97                 }
  98         }
  99         free(lC);
 100 }
 101
 102 bam_maqcns_t *bam_maqcns_init()
 103 {
 104         bam_maqcns_t *bm;
 105         bm = (bam_maqcns_t*)calloc(1, sizeof(bam_maqcns_t));
 106         bm->aux = (bmc_aux_t*)calloc(1, sizeof(bmc_aux_t));
 107         bm->het_rate = 0.001;
 108         bm->theta = 0.85;
 109         bm->n_hap = 2;
 110         bm->eta = 0.03;
 111         return bm;
 112 }
 113
 114 void bam_maqcns_prepare(bam_maqcns_t *bm)
 115 {
 116         cal_coef(bm); cal_het(bm);
 117 }
 118
 119 void bam_maqcns_destroy(bam_maqcns_t *bm)
 120 {
 121         if (bm == 0) return;
 122         free(bm->lhet); free(bm->fk); free(bm->coef); free(bm->aux->info);
 123         free(bm->aux); free(bm);
 124 }
 125
 126 glf1_t *bam_maqcns_glfgen(int _n, const bam_pileup1_t *pl, uint8_t ref_base, bam_maqcns_t *bm)
 127 {
 128         glf_call_aux_t *b;
 129         int i, j, k, w[8], c, n;
 130         glf1_t *g = (glf1_t*)calloc(1, sizeof(glf1_t));
 131         float p[16], min_p = 1e30;
 132
 133         g->ref_base = ref_base;
 134         if (_n == 0) return g;
 135
 136         // construct aux array
 137         if (bm->aux->max < _n) {
 138                 bm->aux->max = _n;
 139                 kroundup32(bm->aux->max);
 140                 bm->aux->info = (uint32_t*)realloc(bm->aux->info, 4 * bm->aux->max);
 141         }
 142         for (i = n = 0; i < _n; ++i) {
 143                 const bam_pileup1_t *p = pl + i;
 144                 uint32_t q, x = 0;
 145                 if (p->is_del || (p->b->core.flag&BAM_FUNMAP)) continue;
 146                 q = (uint32_t)bam1_qual(p->b)[p->qpos];
 147                 x |= (uint32_t)bam1_strand(p->b) << 18 | q << 8 | p->b->core.qual;
 148                 if (p->b->core.qual < q) q = p->b->core.qual;
 149                 x |= q << 24;
 150                 q = bam_nt16_nt4_table[bam1_seqi(bam1_seq(p->b), p->qpos)];
 151                 if (!p->is_del && q < 4) x |= 1 << 21 | q << 16;
 152                 bm->aux->info[n++] = x;
 153         }
 154         ks_introsort(uint32_t, n, bm->aux->info);
 155         // generate esum and fsum
 156         b = (glf_call_aux_t*)calloc(1, sizeof(glf_call_aux_t));
 157         for (k = 0; k != 8; ++k) w[k] = 0;
 158         b->mapQ_max = 0;
 159         for (j = n - 1; j >= 0; --j) { // calculate esum and fsum
 160                 uint32_t info = bm->aux->info[j];
 161                 if (info>>24 < 4 && (info>>8&0x3f) != 0) info = 4<<24 | (info&0xffffff);
 162                 k = info>>16&7;
 163                 if (info>>24 > 0) {
 164                         b->esum[k&3] += bm->fk[w[k]] * (info>>24);
 165                         b->fsum[k&3] += bm->fk[w[k]];
 166                         if (w[k] < 0xff) ++w[k];
 167                         ++b->c[k&3];
 168                 }
 169                 if (b->mapQ_max < (info&0x7f)) b->mapQ_max = info&0x7f;
 170         }
 171         // rescale ->c[]
 172         for (j = c = 0; j != 4; ++j) c += b->c[j];
 173         if (c > 255) {
 174                 for (j = 0; j != 4; ++j) b->c[j] = (int)(254.0 * b->c[j] / c + 0.5);
 175                 for (j = c = 0; j != 4; ++j) c += b->c[j];
 176         }
 177         // generate likelihood
 178         for (j = 0; j != 4; ++j) {
 179                 // homozygous
 180                 float tmp1, tmp3;
 181                 int tmp2, bar_e;
 182                 for (k = 0, tmp1 = tmp3 = 0.0, tmp2 = 0; k != 4; ++k) {
 183                         if (j == k) continue;
 184                         tmp1 += b->esum[k]; tmp2 += b->c[k]; tmp3 += b->fsum[k];
 185                 }
 186                 if (tmp2) {
 187                         bar_e = (int)(tmp1 / tmp3 + 0.5);
 188                         if (bar_e < 4) bar_e = 4; // should not happen
 189                         if (bar_e > 63) bar_e = 63;
 190                         p[j<<2|j] = tmp1 + bm->coef[bar_e<<16|c<<8|tmp2];
 191                 } else p[j<<2|j] = 0.0; // all the bases are j
 192                 // heterozygous
 193                 for (k = j + 1; k < 4; ++k) {
 194                         for (i = 0, tmp2 = 0, tmp1 = tmp3 = 0.0; i != 4; ++i) {
 195                                 if (i == j || i == k) continue;
 196                                 tmp1 += b->esum[i]; tmp2 += b->c[i]; tmp3 += b->fsum[i];
 197                         }
 198                         if (tmp2) {
 199                                 bar_e = (int)(tmp1 / tmp3 + 0.5);
 200                                 if (bar_e < 4) bar_e = 4;
 201                                 if (bar_e > 63) bar_e = 63;
 202                                 p[j<<2|k] = p[k<<2|j] = -4.343 * bm->lhet[b->c[j]<<8|b->c[k]] + tmp1 + bm->coef[bar_e<<16|c<<8|tmp2];
 203                         } else p[j<<2|k] = p[k<<2|j] = -4.343 * bm->lhet[b->c[j]<<8|b->c[k]]; // all the bases are either j or k
 204                 }
 205                 //
 206                 for (k = 0; k != 4; ++k)
 207                         if (p[j<<2|k] < 0.0) p[j<<2|k] = 0.0;
 208         }
 209
 210         // convert necessary information to glf1_t
 211         g->ref_base = ref_base; g->max_mapQ = b->mapQ_max;
 212         g->depth = n > 16777215? 16777215 : n;
 213         for (j = 0; j != 4; ++j)
 214                 for (k = j; k < 4; ++k)
 215                         if (p[j<<2|k] < min_p) min_p = p[j<<2|k];
 216         g->min_lk = min_p > 255.0? 255 : (int)(min_p + 0.5);
 217         for (j = c = 0; j != 4; ++j)
 218                 for (k = j; k < 4; ++k)
 219                         g->lk[c++] = p[j<<2|k]-min_p > 255.0? 255 : (int)(p[j<<2|k]-min_p + 0.5);
 220
 221         free(b);
 222         return g;
 223 }
 224
 225 uint32_t glf2cns(const glf1_t *g, int q_r)
 226 {
 227         int i, j, k, tmp[16], min = 10000, min2 = 10000, min3 = 10000, min_g = -1, min_g2 = -1;
 228         uint32_t x = 0;
 229         for (i = k = 0; i < 4; ++i)
 230                 for (j = i; j < 4; ++j) {
 231                         tmp[j<<2|i] = -1;
 232                         tmp[i<<2|j] = g->lk[k++] + (i == j? 0 : q_r);
 233                 }
 234         for (i = 0; i < 16; ++i) {
 235                 if (tmp[i] < 0) continue;
 236                 if (tmp[i] < min) {
 237                         min3 = min2; min2 = min; min = tmp[i]; min_g2 = min_g; min_g = i;
 238                 } else if (tmp[i] < min2) {
 239                         min3 = min2; min2 = tmp[i]; min_g2 = i;
 240                 } else if (tmp[i] < min3) min3 = tmp[i];
 241         }
 242         x = min_g >= 0? (1U<<(min_g>>2&3) | 1U<<(min_g&3)) << 28 : 0xf << 28;
 243         x |= min_g2 >= 0? (1U<<(min_g2>>2&3) | 1U<<(min_g2&3)) << 24 : 0xf << 24;
 244         x |= (uint32_t)g->max_mapQ << 16;
 245         x |= min2 < 10000? (min2 - min < 256? min2 - min : 255) << 8 : 0xff << 8;
 246         x |= min2 < 10000 && min3 < 10000? (min3 - min2 < 256? min3 - min2 : 255) : 0xff;
 247         return x;
 248 }
 249
 250 uint32_t bam_maqcns_call(int n, const bam_pileup1_t *pl, bam_maqcns_t *bm)
 251 {
 252         glf1_t *g;
 253         uint32_t x;
 254         if (n) {
 255                 g = bam_maqcns_glfgen(n, pl, 0xf, bm);
 256                 x = glf2cns(g, (int)(bm->q_r + 0.5));
 257                 free(g);
 258         } else x = 0xfU<<28 | 0xfU<<24;
 259         return x;
 260 }
 261
 262 /************** *****************/
 263
 264 bam_maqindel_opt_t *bam_maqindel_opt_init()
 265 {
 266         bam_maqindel_opt_t *mi = (bam_maqindel_opt_t*)calloc(1, sizeof(bam_maqindel_opt_t));
 267         mi->q_indel = 40;
 268         mi->r_indel = 0.00015;
 269         //
 270         mi->mm_penalty = 3;
 271         mi->indel_err = 4;
 272         mi->ambi_thres = 10;
 273         return mi;
 274 }
 275
 276 void bam_maqindel_ret_destroy(bam_maqindel_ret_t *mir)
 277 {
 278         if (mir == 0) return;
 279         free(mir->s[0]); free(mir->s[1]); free(mir);
 280 }
 281
 282 #define MINUS_CONST 0x10000000
 283
 284 bam_maqindel_ret_t *bam_maqindel(int n, int pos, const bam_maqindel_opt_t *mi, const bam_pileup1_t *pl, const char *ref)
 285 {
 286         int i, j, n_types, *types, left, right;
 287         bam_maqindel_ret_t *ret = 0;
 288         for (i = 0; i < n; ++i) {
 289                 const bam_pileup1_t *p = pl + i;
 290                 if (!(p->b->core.flag&BAM_FUNMAP) && p->indel != 0) break;
 291         }
 292         if (i == n) return 0; // no indel
 293         { // calculate how many types of indels are available (set n_types and types)
 294                 int m;
 295                 uint32_t *aux;
 296                 aux = (uint32_t*)calloc(n+1, 4);
 297                 m = 0;
 298                 aux[m++] = MINUS_CONST; // zero indel is always a type
 299                 for (i = 0; i < n; ++i) {
 300                         const bam_pileup1_t *p = pl + i;
 301                         if (!(p->b->core.flag&BAM_FUNMAP) && p->indel != 0)
 302                                 aux[m++] = MINUS_CONST + p->indel;
 303                 }
 304                 ks_introsort(uint32_t, m, aux);
 305                 n_types = 1;
 306                 for (i = 1; i < m; ++i)
 307                         if (aux[i] != aux[i-1]) ++n_types;
 308                 types = (int*)calloc(n_types, sizeof(int));
 309                 j = 0;
 310                 types[j++] = aux[0] - MINUS_CONST;
 311                 for (i = 1; i < m; ++i) {
 312                         if (aux[i] != aux[i-1])
 313                                 types[j++] = aux[i] - MINUS_CONST;
 314                 }
 315                 free(aux);
 316         }
 317         { // calculate left and right boundary
 318                 bam_segreg_t seg;
 319                 left = 0x7fffffff; right = 0;
 320                 for (i = 0; i < n; ++i) {
 321                         const bam_pileup1_t *p = pl + i;
 322                         if (!(p->b->core.flag&BAM_FUNMAP)) {
 323                                 bam_segreg(pos, &p->b->core, bam1_cigar(p->b), &seg);
 324                                 if (seg.tbeg < left) left = seg.tbeg;
 325                                 if (seg.tend > right) right = seg.tend;
 326                         }
 327                 }
 328                 if (pos - left > MAX_WINDOW) left = pos - MAX_WINDOW;
 329                 if (right - pos> MAX_WINDOW) right = pos + MAX_WINDOW;
 330         }
 331         { // the core part
 332                 char *ref2, *inscns = 0;
 333                 int k, l, *score, *pscore, max_ins = types[n_types-1];
 334                 ref2 = (char*)calloc(right - left + types[n_types-1] + 2, 1);
 335                 if (max_ins > 0) { // get the consensus of inserted sequences
 336                         int *inscns_aux = (int*)calloc(4 * n_types * max_ins, sizeof(int));
 337                         // count occurrences
 338                         for (i = 0; i < n_types; ++i) {
 339                                 if (types[i] <= 0) continue; // not insertion
 340                                 for (j = 0; j < n; ++j) {
 341                                         const bam_pileup1_t *p = pl + j;
 342                                         if (!(p->b->core.flag&BAM_FUNMAP) && p->indel == types[i]) {
 343                                                 for (k = 1; k <= p->indel; ++k) {
 344                                                         int c = bam_nt16_nt4_table[bam1_seqi(bam1_seq(p->b), p->qpos + k)];
 345                                                         if (c < 4) ++inscns_aux[i*max_ins*4 + (k-1)*4 + c];
 346                                                 }
 347                                         }
 348                                 }
 349                         }
 350                         // construct the consensus of inserted sequence
 351                         inscns = (char*)calloc(n_types * max_ins, sizeof(char));
 352                         for (i = 0; i < n_types; ++i) {
 353                                 for (j = 0; j < types[i]; ++j) {
 354                                         int max = 0, max_k = -1, *ia = inscns_aux + i*max_ins*4 + j*4;
 355                                         for (k = 0; k < 4; ++k) {
 356                                                 if (ia[k] > max) {
 357                                                         max = ia[k];
 358                                                         max_k = k;
 359                                                 }
 360                                         }
 361                                         inscns[i*max_ins + j] = max? 1<<max_k : 15;
 362                                 }
 363                         }
 364                         free(inscns_aux);
 365                 }
 366                 // calculate score
 367                 score = (int*)calloc(n_types * n, sizeof(int));
 368                 pscore = (int*)calloc(n_types * n, sizeof(int));
 369                 for (i = 0; i < n_types; ++i) {
 370                         // write ref2
 371                         for (k = 0, j = left; j <= pos; ++j)
 372                                 ref2[k++] = bam_nt16_table[(int)ref[j]];
 373                         if (types[i] <= 0) j += -types[i];
 374                         else for (l = 0; l < types[i]; ++l)
 375                                          ref2[k++] = inscns[i*max_ins + l];
 376                         for (; j < right && ref[j]; ++j)
 377                                 ref2[k++] = bam_nt16_table[(int)ref[j]];
 378                         // calculate score for each read
 379                         for (j = 0; j < n; ++j) {
 380                                 const bam_pileup1_t *p = pl + j;
 381                                 uint32_t *cigar;
 382                                 bam1_core_t *c = &p->b->core;
 383                                 int s, ps;
 384                                 bam_segreg_t seg;
 385                                 if (c->flag&BAM_FUNMAP) continue;
 386                                 cigar = bam1_cigar(p->b);
 387                                 bam_segreg(pos, c, cigar, &seg);
 388                                 for (ps = s = 0, l = seg.qbeg; c->pos + l < right && l < seg.qend; ++l) {
 389                                         int cq = bam1_seqi(bam1_seq(p->b), l), ct;
 390                                         ct = c->pos + l >= left? ref2[c->pos + l - left] : 15; // "<" will happen if reads are too long
 391                                         if (cq < 15 && ct < 15) {
 392                                                 s += cq == ct? 1 : -mi->mm_penalty;
 393                                                 if (cq != ct) ps += bam1_qual(p->b)[l];
 394                                         }
 395                                 }
 396                                 score[i*n + j] = s; pscore[i*n + j] = ps;
 397                                 if (types[i] != 0) { // then try the other way to calculate the score
 398                                         for (ps = s = 0, l = seg.qbeg; c->pos + l + types[i] < right && l < seg.qend; ++l) {
 399                                                 int cq = bam1_seqi(bam1_seq(p->b), l), ct;
 400                                                 ct = c->pos + l + types[i] >= left? ref2[c->pos + l + types[i] - left] : 15;
 401                                                 if (cq < 15 && ct < 15) {
 402                                                         s += cq == ct? 1 : -mi->mm_penalty;
 403                                                         if (cq != ct) ps += bam1_qual(p->b)[l];
 404                                                 }
 405                                         }
 406                                 }
 407                                 if (score[i*n+j] < s) score[i*n+j] = s; // choose the higher of the two scores
 408                                 if (pscore[i*n+j] > ps) pscore[i*n+j] = ps;
 409                                 if (types[i] != 0) score[i*n+j] -= mi->indel_err;
 410                                 //printf("%d, %d, %d, %d\n", i, types[i], j, score[i*n+j]);
 411                         }
 412                 }
 413                 { // get final result
 414                         int *sum, max1, max2, max1_i, max2_i;
 415                         // pick up the best two score
 416                         sum = (int*)calloc(n_types, sizeof(int));
 417                         for (i = 0; i < n_types; ++i)
 418                                 for (j = 0; j < n; ++j)
 419                                         sum[i] += -pscore[i*n+j];
 420                         max1 = max2 = -0x7fffffff; max1_i = max2_i = -1;
 421                         for (i = 0; i < n_types; ++i) {
 422                                 if (sum[i] > max1) {
 423                                         max2 = max1; max2_i = max1_i; max1 = sum[i]; max1_i = i;
 424                                 } else if (sum[i] > max2) {
 425                                         max2 = sum[i]; max2_i = i;
 426                                 }
 427                         }
 428                         free(sum);
 429                         // write ret
 430                         ret = (bam_maqindel_ret_t*)calloc(1, sizeof(bam_maqindel_ret_t));
 431                         ret->indel1 = types[max1_i]; ret->indel2 = types[max2_i];
 432                         ret->s[0] = (char*)calloc(abs(ret->indel1) + 2, 1);
 433                         ret->s[1] = (char*)calloc(abs(ret->indel2) + 2, 1);
 434                         // write indel sequence
 435                         if (ret->indel1 > 0) {
 436                                 ret->s[0][0] = '+';
 437                                 for (k = 0; k < ret->indel1; ++k)
 438                                         ret->s[0][k+1] = bam_nt16_rev_table[(int)inscns[max1_i*max_ins + k]];
 439                         } else if (ret->indel1 < 0) {
 440                                 ret->s[0][0] = '-';
 441                                 for (k = 0; k < -ret->indel1 && ref[pos + k + 1]; ++k)
 442                                         ret->s[0][k+1] = ref[pos + k + 1];
 443                         } else ret->s[0][0] = '*';
 444                         if (ret->indel2 > 0) {
 445                                 ret->s[1][0] = '+';
 446                                 for (k = 0; k < ret->indel2; ++k)
 447                                         ret->s[1][k+1] = bam_nt16_rev_table[(int)inscns[max2_i*max_ins + k]];
 448                         } else if (ret->indel2 < 0) {
 449                                 ret->s[1][0] = '-';
 450                                 for (k = 0; k < -ret->indel2 && ref[pos + k + 1]; ++k)
 451                                         ret->s[1][k+1] = ref[pos + k + 1];
 452                         } else ret->s[1][0] = '*';
 453                         // write count
 454                         for (j = 0; j < n; ++j) {
 455                                 if (score[max1_i*n+j] < 0 && score[max2_i*n+j] < 0) ++ret->cnt_anti;
 456                                 else {
 457                                         int diff = score[max1_i*n+j] - score[max2_i*n+j];
 458                                         if (diff > mi->ambi_thres) ++ret->cnt1;
 459                                         else if (diff < -mi->ambi_thres) ++ret->cnt2;
 460                                         else ++ret->cnt_ambi;
 461                                 }
 462                         }
 463                         // write gl[]
 464                         ret->gl[0] = ret->gl[1] = 0;
 465                         for (j = 0; j < n; ++j) {
 466                                 int s1 = pscore[max1_i*n + j], s2 = pscore[max2_i*n + j];
 467                                 //printf("%d, %d\n", s1, s2);
 468                                 if (s1 > s2) ret->gl[0] += s1 - s2 < mi->q_indel? s1 - s2 : mi->q_indel;
 469                                 else ret->gl[1] += s2 - s1 < mi->q_indel? s2 - s1 : mi->q_indel;
 470                         }
 471                 }
 472                 free(score); free(pscore); free(ref2); free(inscns);
 473         }
 474         { // call genotype
 475                 int q[3], qr_indel = (int)(-4.343 * log(mi->r_indel) + 0.5);
 476                 int min1, min2, min1_i;
 477                 q[0] = ret->gl[0] + (ret->s[0][0] != '*'? 0 : 0) * qr_indel;
 478                 q[1] = ret->gl[1] + (ret->s[1][0] != '*'? 0 : 0) * qr_indel;
 479                 q[2] = n * 3 + (ret->s[0][0] == '*' || ret->s[1][0] == '*'? 1 : 1) * qr_indel;
 480                 min1 = min2 = 0x7fffffff; min1_i = -1;
 481                 for (i = 0; i < 3; ++i) {
 482                         if (q[i] < min1) {
 483                                 min2 = min1; min1 = q[i]; min1_i = i;
 484                         } else if (q[i] < min2) min2 = q[i];
 485                 }
 486                 ret->gt = min1_i;
 487                 ret->q_cns = min2 - min1;
 488                 // set q_ref
 489                 if (ret->gt < 2) ret->q_ref = (ret->s[ret->gt][0] == '*')? 0 : q[1-ret->gt] - q[ret->gt] - qr_indel - 3;
 490                 else ret->q_ref = (ret->s[0][0] == '*')? q[0] - q[2] : q[1] - q[2];
 491                 if (ret->q_ref < 0) ret->q_ref = 0;
 492         }
 493         free(types);
 494         return ret;
 495 }